2D电泳及质谱鉴定技术服务

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1、2D电泳及质谱鉴定技术服务——生工带您走进蛋白质组学时代◊实验原理：1、双向凝胶电泳是将不同种类的蛋口质按照等电点和分子虽差界进行高分辨率分离的分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是冃前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件(ImageMaster等)进行图谱差亓分析，找到差别点。然后把差开点切出，进行脱色、酶解。最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。通过搜库可得到差异蛋门质的详细信息。2、ABI4800串联质谱(MA

2、LDI-TOF-TOFTIS)是目前对SDS-PAGE胶上的蛋白条带和2D胶上差异点蛋白，切取并经过酶解后进行鉴定最常用的质谱，它在肽指纹图谱(一级质谱)的基础上选择强度最大的10个峰进行进行二级质谱，对肽段碎片的分子童椿确测定，再将-级和二级质谱数据整合并使用GPS3.6(AppliedBiosystems)和Mascot2.1(M^itrixScience)对质谱数据进行分析和蛋口鉴定。淇提供的专一•性信息丰富，对于数据库的检索，特别是对数据量丰富、兀余信息多的数据库的检索，其鉴定结果比肽指纹

3、图谱可靠的多，该ABI4800也可以不经过爾解市接对蛋白进行分子量粘俺测定。经典蛋白质组学研究策略◊主要步骤：1、样品制备(蛋白捉取)：主要包括杭物、动物细胞或纽织等的破碎、离心以及定盘。2、第一向IEF等电聚焦实验。3、第二向SDS-PAGE实验。4、硝酸银染色或考马斯亮蓝染色。5、图像分析及数据处理。6、提供双向电泳的正式实验报告。7、选取感兴趣的蛋白点进行酚解。8、对酗解后蛋白进行质谱技术分析(Maldi-Tof-Tof/MS)e9、捉供质谱的正式实验报告。◊所需仪器:Maldi-Tof-T

4、of内皮细胞诱导前后蛋rI变化最及差异蛋ri分析◊提供结果：“贵白定鼠信息-■份/预实验报告--份/胶图扫描结果图片（预实验+正式试齡）/ImageMaster软件分析报告（差异点列表、差异点对应位置图、纽内差异点强度柱状图及组内差异点强度列表）/正实验报告-•份/Maldi-Tof-Tof/MS鉴定报告（成功率、库信息、蛋白查库结果等）◊样品要求：3、样品需为可溶的固体蛋白或液体蛋白溶液，建议液体蛋白溶解体系为8U床素/4%CHAPS/40mMTris/65mMDTT。如溶解于其它缓冲液体系中，

5、请应提供缓冲懣成分。4、单次硝酸银染色提供贵白最不小于0.3mg；单次考马斯亮蓝染色提供銀白录不小于lmg；总蛋白量不小于2mg。5、用于一次制备型样品，动物组织或菌体的新鲜样本始终不小于500mg：收集细胞数虽不小于1X10植物或真菌样晶湿重不小于2g；6、为避免蛋白样品降解，得户所奇的蛋白样本最好为冻干品，若为溶液蛋白，则需低温保存，血液血浆样品应贮于「C保存，其它液体蛋白溶液贮于-209保存。（外地客户如需进行样品邮递请使用干冰）7、如样品屮含有杂质例如核酸、脂类、多旃、色素类等或需其它特

6、殊耍求例如浓缩、透析等请捉前吿知。我们将根据具体情况对实验方案做出相应调整.服务价格:服务名称价格样品制备500-1100元/样蛋口定量200元IEF及2DE(13cm)预实验及正式试验150070/块制备实验1500元SDS-PAGE(7cm)600元/块图像分析处理800元切胶500元SDS-PAGEGel银染串联质谱考染串联质谱2DGel甲耳尺少1时五:疋>»U1/1>直接分子呈测定PMF（肽指纹图谱）常见问题分析：1.等电聚焦为什么电压上不去？主要是提取的蛋白样品中离了含屋过高，通过适当

7、修改蛋白提取方法比如采用除盐试剂盒、滤膜过滤或者丙酮沉淀等方法可以获得较好的效果。2.双向电泳图谱的橫条纹与等电聚焦有什么关系？等电聚焦不完全或者聚焦过度都会引起双向电泳图谱中横条纹的产生，不同的是等电聚焦不完全导致的横条纹较模糊目较粗,而等电聚焦过度形成的横条纹则较为淸晰和细小。介适的等电聚焦时间的设置需耍根据胶条长度、P11范惘以及上样量等因索综合考虑。3.质谱鉴定取胶点该如何取？有什么注总爭项？取点时将0.2ml的枪头前端剪去一段，用该枪头将凝胶戡取下來并转移至0.5ml离心管中，用水将胶粒

8、反复吸打冲洗两至三次，最后吸干离心管中所右水分后封盖保存并做好标记。离心管最好用进口离心管；水最好用去离•子水：取点时嚴好带上口罩与手套，以免丹蛋白污染。针对特别小的蛋白点，枪头孔径可能会比蛋白点而枳大，取点时把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下來也不要紧，只有胶图上消晰可见的蛋白点，其含量就足够用于质谱鉴定，所以只要取一次蛋白点就可以了，不需要把儿张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定，同时注怠不要把胶点弄得太碎，条件允许的话可以命取-次胶点的亟复以做好备份°4.蛋白凝胶足否可以氏