生化检验技术基础

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1、生化检验技术基础与进展上海长征医院实验诊断科于嘉屏一、比色分析1．比色分析理论――Beer-Lambert定律A=lg（I0/I）＝KCL或I＝I0×10-KCLI0：入射光强度I：透过光强度K：常数C：溶液浓度L：溶液的厚度（1）郎伯定律I0ItlL-dI∝Idl，-dI＝aIdl，dI/I=-adl积分ItLdI/I＝-adl得：ln(I0/It)＝-aLI00将ln改为lg，则为：lg（I0/It）＝-0.434aL＝K’L令lg（I0/It）＝A，则A＝K’L（2）比尔定律A＝K”C（3）郎伯-比尔定律A＝KLC透光率（transmittance，T，透射率）T＝I/

2、I0吸光度（absorbance，A）光密度（epticaldensity，D或OD）A＝lgI0/I＝-lgTT＝10-A＝10-KCLA＝KCL当L用cm，C用mol/L表示，则K即称之为摩尔吸光系数，用ε表示。当C＝1mol/L，L＝1cm，则ε＝A。T％与A的关系－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－透光率（T）吸光度（A）－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－10.0000.750.1250.50.3010.250.6020.170.7700.11.0000.051.3010.012.0000.0013.000－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2．影响

3、因素（1）化学因素的影响溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。（2）非单色光的影响比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。波长的选择可见绿色带黄深黄桔红深红深紫青紫紫蓝蓝色带绿绿色带蓝深绿Ultra-violet紫外200~400深紫深红桔红深黄绿色带黄暗绿绿色带蓝蓝色带绿紫蓝青紫被测溶液颜色颜色750~800610~750595~610560~580580~595

4、500~560490~500480~490435~480400~435波长(nm)（3）光学因素的影响散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。（4）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度L增大而影响测量值。3．比色法的误差（1）仪器误差滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。（2）方法误差（3）操作误差比色法举例1.总蛋白(TP)蛋白质中的肽键+Cu2+碱性条件紫红色络合物引起在波长540~560nm范围内吸光度的上升,与总蛋白含量成正比2.白蛋白(A

5、LB)白蛋白+溴甲酚绿pH4.2白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升,与白蛋白含量成正比二、分光光度计1．光源热光源:钨灯、卤钨灯（320～2500nm）气体放电光源：氢灯、氘灯（185～375nm）。氘灯发光强度比氢灯强3～5倍，是目前紫外光区常用光源。2.单色器单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。(1)棱镜玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于350～3000nm的波长范围。石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-4000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力

6、差。(2)光栅光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。3．比色杯比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻璃适用于350nm以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。4．检测器在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。光电池光电管光电倍增管双波长分光光度计来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为λ1和λ2的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射

7、吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差△A。三、酶法分析酶法分析包括两方面的内容：①借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。②借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。葡萄糖葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸＋H2O2H2O2＋苯酚＋4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺＋H2O尿素尿素＋H2O脲酶2NH4+＋CO2NH4+＋α-酮戊二酸＋NADH谷氨酸脱氢酶谷氨酸＋NAD+