聚合链变酶基础知识

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1、聚合酶琏式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是一种分了生物学技术,用于放人特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。目录概述PCR原理1PCR反应体系与反应条件11、标准的PCR反应体系12、PCR引物设计13、模板的制备14、PCR反应条件的控制1PCR的循环参数1k(Initialdenaturation)12、循坏屮的变性步骤13、引物退火(Primerannealinq)14、引物延伸15、循环数16、最后延伸1PCR步骤11.DNA变性12.退火13.延伸PCR检测1PCR反应特点特异性强1灵敏度高1简便、快速1对标木的纯度要求低P

2、CR仪器PCR常见问题PCR实验室的建立方法1、实验室布局2、设置标准概述DNA聚合酚(DNAoolvmeraseI)最早于1955年发现，而较具冇实验价值及实川性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使Z变性，因此不符合使川高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶（简称Taqpolymerase）,则是聚合酶链式反应示虑图[1]于1976年从温泉屮的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念

3、是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了笫一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出來的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的,Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了笫一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难职其项背。随后PCR技术在牛物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术oMullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。PC

4、R原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验屮发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物,DNA聚仑酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酚在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合fW-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90°C以上的高温而不失活，

5、不需要每个循环加酚，使PCR技术变得非常简捷、同时也人人降低了成木，PCR技术得以人⑵量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特界性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。PCR山变性-退火-延伸三个基木反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使Z成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延仲:DNA模板-引物结合物在TaaDN

6、A聚介酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱棊互补觇对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火■■延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链乂可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小吋就能将待扩目的基因扩增放大儿百万倍。PCR反应体系与反应条件1•标准的PCR反应体系1Ox扩増缓冲液10

7、.il4种dNTP混合物200pl引物10〜100^1模板DNA0.1~2pgTaqDNA聚合酶2.5plMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100plPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物（P

8、CR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。但基本原则相同PCRY[3]PCR所用的酶主要有两种來源：Taq和Pfu«分别來自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的DNA,可以是任何来源，但冇两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液