实时荧光定量聚合酶链反应与酶链免疫法检测儿童疱疹

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1、实时荧光定量聚合酶链反应与酶链免疫法检测儿童疱疹[摘要] 目的:比较实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)与酶链免疫法(ELISA)两种不同方法检测传染性单核细胞增多症儿童及正常儿童疱疹病毒(EBV)感染与临床符合情况。方法:应用实时荧光定量PCR与ELISA法同步平行检测我院2006年1月至6月期间125例被临床诊断为传染性单核细胞增多症的儿童发烧第7天及50例门诊体检健康的儿童血标本中EBV的检出率。结果:125名传染性单核细胞增多症儿童中,其中1周岁以下20名,4周岁~10周岁105名,PCR法检出124例,阳性符合率99.2%。ELISA法检出107例阳性符合率85.6%,但1周岁

2、以下的20名儿童,PCR法检出19例,阳性符合率95%,而ELISA法检出10例,阳性符合率仅为50%;50例健康儿童,PCR法检出49例,阴性符合率98%,ELISA法检出42例,阴性符合率84%。结论:PCR法与ELISA法比较,前者的阳性及阴性检出率均明显优于后者,特别是对于1周岁以下的儿童。与ELISA法相比PCR法是一个快速、敏感、特异的检测方法,可帮助临床明确诊断及早治疗。  [关键词] 疱疹病毒;酶链免疫;实时荧光定量聚合酶链反应;传染性单核细胞增多症  EBV又称人疱疹病毒4型,属于r疱疹病毒亚科淋巴滤泡病毒属成员,1968年Henle等证明EBV是传染性单核细胞增多症

3、的病原体。全世界约有80%~90%成年人感染过EBV,初次感染者一般发生在10岁以前[1]。传染性单核细胞增多症的并发症包括脾肿大、肝炎、心包炎或累及中枢神经系统,故对于儿童明确诊断及早治疗尤为重要。本实验目的是对PCR法与ELISA法检测儿童EBV感染进行临床应用的比较及评价。  1 材料与方法  1.1 仪器 上海枫岭生物有限公司提供的FTC—2000型实时荧光定量PCR仪;上海迅达医疗仪器有限公司提供的XD—711酶标分析仪;北京拓普分析仪器有限责任公司提供的DEM—Ⅲ型自动酶标洗板机。  1.2 试剂 中山大学达安基因股份有限公司提供的EBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒;北京北方

4、生物技术研究所提供的EB病毒IgMVCA,检测试剂盒(VCA即衣壳抗原)。  1.3 标本 阳性对照组125例均来自我院被临床诊断为传染性单核细胞增多症的住院儿童(其中1周岁以下20名);阴性对照组50例均来自我院门诊体检的健康儿童,同时平行抽取1.5ml~2.0ml血液枸橼酸钠抗凝,用于PCR法检测;抽取1.0ml血液注入干燥管用于ELISA法检测。  1.4 操作  1.4.1 PCR法 将上述抗凝的血液标本低速离心取血浆40μl加等量DNA裂解液充分混匀提取DNA,得到的溶有DNA的水相准确吸取2 μl,直接用于PCR扩增。扩增条件为:93℃120s1个循环;93℃45s55℃

5、60s10个循环;93℃30 s55℃45 s35个循环。在55℃45s时采集荧光强度。试剂盒提供的阳性标准品(104~107)以及阴性对照、空白对照、临界值对照同时扩增,得出所测标本的核酸载量值,用拷贝/ml表示,为方便比较将≥103视为阳性,<103为阴性。  4.2 ELISA法 将上述未抗凝的血液标本,待自然凝固后,低速离心,取血清1∶10稀释,严格按照试剂盒所要求的操作步骤进行操作,同时作空白、阴性、阳性对照各2孔。用酶标仪读数,取波长450nm,先用空白对照孔调零,然后测定各孔OD值。判断值(CO)=阴性对照平均OD值×2.1样品OD值大于、等于判断值为阳性;小于判断

6、值为阴性。  2 结果  阳性对照组结果见表1。  表1 PCR法与ELISA法阳性对照组结果(略)  1周岁以下的20名儿童阳性检出率见表2。    表2 1周岁以下20名儿童两种方法阳性比较(略)    阴性对照组结果见表3。  表3 阳性对照组结果(略)  125名传染性单核细胞增多症儿童中(1周岁以下20人)PCR法检出124例阳性检出率99.2%,ELISA法检出107例,阳性检出率85.6%,但对于其中1周岁的20名儿童,PCR法检出19例,阳性检出率达95.0%,而ELISA法仅检出10例,阳性检出率仅为50.0%。对50名健康儿童PCR法检出49例,阴性检出率为98.0

7、%,ELISA法检出42例,阴性检出率为84.0%。  3 讨论  由于EBV体外培养唯一的易感细胞为新鲜分离的人脐带血B淋巴细胞,而且标准的脐带血淋巴细胞转化方法需2周~4周的时间,用时太长使EBV的分离培养用于临床诊断没有意义。近几年来由于ELISA法的广泛应用,且IgMVCA在初次感染时很早出现,4周后消失,因此临床上大多在初次感染时ELISA法检测IgMVCA在临床上应用较为广泛,但有文献报道初次感染的诊断不能依赖于IgMVCA的

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