实时荧光定量聚合酶链反应与酶链免疫法检测儿童疱疹

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1、实时荧光定量聚合酶链反应与酶链免疫法检测儿童疱疹［摘要］　目的：比较实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)与酶链免疫法(ELISA)两种不同方法检测传染性单核细胞增多症儿童及正常儿童疱疹病毒(EBV)感染与临床符合情况。方法：应用实时荧光定量PCR与ELISA法同步平行检测我院2006年1月至6月期间125例被临床诊断为传染性单核细胞增多症的儿童发烧第7天及50例门诊体检健康的儿童血标本中EBV的检出率。结果：125名传染性单核细胞增多症儿童中，其中1周岁以下20名，4周岁～10周岁105名，PCR法检出124例，阳性符合率99.2％。ELISA法检出107例阳性符合率85.6％，但1周岁

2、以下的20名儿童，PCR法检出19例，阳性符合率95％，而ELISA法检出10例，阳性符合率仅为50％；50例健康儿童，PCR法检出49例，阴性符合率98％，ELISA法检出42例，阴性符合率84％。结论：PCR法与ELISA法比较，前者的阳性及阴性检出率均明显优于后者，特别是对于1周岁以下的儿童。与ELISA法相比PCR法是一个快速、敏感、特异的检测方法，可帮助临床明确诊断及早治疗。　　［关键词］　疱疹病毒；酶链免疫；实时荧光定量聚合酶链反应；传染性单核细胞增多症　　EBV又称人疱疹病毒4型，属于r疱疹病毒亚科淋巴滤泡病毒属成员，1968年Henle等证明EBV是传染性单核细胞增多症

3、的病原体。全世界约有80％～90％成年人感染过EBV，初次感染者一般发生在10岁以前［1］。传染性单核细胞增多症的并发症包括脾肿大、肝炎、心包炎或累及中枢神经系统，故对于儿童明确诊断及早治疗尤为重要。本实验目的是对PCR法与ELISA法检测儿童EBV感染进行临床应用的比较及评价。　　1　材料与方法　　1.1　仪器　上海枫岭生物有限公司提供的FTC—2000型实时荧光定量PCR仪;上海迅达医疗仪器有限公司提供的XD—711酶标分析仪;北京拓普分析仪器有限责任公司提供的DEM—Ⅲ型自动酶标洗板机。　　1.2　试剂　中山大学达安基因股份有限公司提供的EBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒；北京北方

4、生物技术研究所提供的EB病毒IgMVCA，检测试剂盒(VCA即衣壳抗原)。　　1.3　标本　阳性对照组125例均来自我院被临床诊断为传染性单核细胞增多症的住院儿童(其中1周岁以下20名)；阴性对照组50例均来自我院门诊体检的健康儿童，同时平行抽取1.5ml～2.0ml血液枸橼酸钠抗凝，用于PCR法检测；抽取1.0ml血液注入干燥管用于ELISA法检测。　　1.4　操作　　1.4.1　PCR法　将上述抗凝的血液标本低速离心取血浆40μl加等量DNA裂解液充分混匀提取DNA，得到的溶有DNA的水相准确吸取2　μl，直接用于PCR扩增。扩增条件为：93℃120s1个循环；93℃45s55℃

5、60s10个循环；93℃30　s55℃45　s35个循环。在55℃45s时采集荧光强度。试剂盒提供的阳性标准品(104～107)以及阴性对照、空白对照、临界值对照同时扩增，得出所测标本的核酸载量值，用拷贝/ml表示，为方便比较将≥103视为阳性，<103为阴性。　　4.2　ELISA法　将上述未抗凝的血液标本，待自然凝固后，低速离心，取血清1∶10稀释，严格按照试剂盒所要求的操作步骤进行操作，同时作空白、阴性、阳性对照各2孔。用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白对照孔调零，然后测定各孔OD值。判断值(CO)=阴性对照平均OD值×2.1样品OD值大于、等于判断值为阳性；小于判断

6、值为阴性。　　2　结果　　阳性对照组结果见表1。　　表1　PCR法与ELISA法阳性对照组结果(略)　　1周岁以下的20名儿童阳性检出率见表2。　　　　表2　1周岁以下20名儿童两种方法阳性比较(略)　　　　阴性对照组结果见表3。　　表3　阳性对照组结果(略)　　125名传染性单核细胞增多症儿童中(1周岁以下20人)PCR法检出124例阳性检出率99.2％，ELISA法检出107例，阳性检出率85.6％，但对于其中1周岁的20名儿童，PCR法检出19例，阳性检出率达95.0％，而ELISA法仅检出10例，阳性检出率仅为50.0％。对50名健康儿童PCR法检出49例，阴性检出率为98.0

7、％，ELISA法检出42例，阴性检出率为84.0％。　　3　讨论　　由于EBV体外培养唯一的易感细胞为新鲜分离的人脐带血B淋巴细胞，而且标准的脐带血淋巴细胞转化方法需2周～4周的时间，用时太长使EBV的分离培养用于临床诊断没有意义。近几年来由于ELISA法的广泛应用，且IgMVCA在初次感染时很早出现，4周后消失，因此临床上大多在初次感染时ELISA法检测IgMVCA在临床上应用较为广泛，但有文献报道初次感染的诊断不能依赖于IgMVCA的