黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及dna聚合酶γ表达的影响论文

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1、黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响论文张涛金英魏晓东王明富王跃新田丽华【摘要】目的探讨黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响。方法选用昆明小鼠，用D半乳糖致成亚急性衰老模型，并观察药物对小鼠呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ的活性及DNA聚合酶γmRNA的表达。通过RTPCR法检测衰老小鼠肝线粒体中DNA聚合酶γ基因在mRNA水平的变化。结果黄精多糖可提高衰老小鼠呼吸链酶活性，降低DNA聚合酶γmRNA的表达。结论黄精多糖可以通过改善肝线粒体能量代谢，使DNA聚合酶γmRN

2、A表达减少，提高呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ而起到延缓衰老的作用。【关键词】黄精多糖;线粒体;呼吸链复合体;DNA聚合酶γ许多研究证明，线粒体DNA(mtDNA)损伤呈增龄性积累，且与生物衰老之间存在高度的相关性〔1.freelg/kg，青年对照组注射等量的生理盐水，连续4g/kg予以灌胃，青年组、衰老组灌服等量的温开水，连续4in离心10min，弃沉淀，取上清液以10000r/min高速冷冻离心机离心15min，沉淀物即为线粒体，将分离的线粒体悬浮于冰冷的匀浆介质中制备成混悬液，反复冻融使线粒体膜破裂，备用。1.4.

3、3肝脏总RNA提取取出的肝组织，用DEPC处理过的生理盐水清洗，锡纸包好，放入液氮中冻存。在液氮中研磨50～100mg放入1mlTrizol内剧烈震荡，静置5min，加氯仿200μl，震荡15s，4℃静置2.0～3.0min，12000r/min离心15min，取上清液置于EP管中，加异丙醇500μl，4℃静置10min，12000r/min离心10min，弃上清，用75%的乙醇1ml洗沉淀，4℃离心7500r/min5min，弃上清，自然干燥。制成RNA溶液以分光光度法进行定量，测光密度A260/A280比值。采

4、用甲醛变性电泳检测RNA完整性。1.4.4PCR引物〔4〕DNA聚合酶γ上游5′TCAAGGAAGTCACGATGG3′;下游5′AGGCACTGGTCAATGTCTAC3′，预计扩增片段470bp。GAPDH上游5′GGAGTTGCTGTTGAAGTCG3′;下游5′GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3′，预计扩增片段599bp。1.4.5RTPCR参照TaKaRaRNALAPCRTMKit(AMV)Ver3.0介绍的方法。混匀后置于30℃10min，50℃30min，99℃5min，5℃

5、5min合成cDNA。PCR反应体系反应条件94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，30个循环。1.4.6电泳与凝胶成像取4μlPCR扩增产物、2μl上样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶水平电泳上做产物检测分析，电压80V，电泳1.5h，EB染色，经YLN2000凝胶成像分析系统照相分析，用DNA聚合酶γmRNA产物的OD值与GAPDHmRNA产物的OD值作为DNA聚合酶γ产物的相对含量。1.5线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的测定〔5〕在样品杯中加入0.2mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液1.5ml，10m

6、ol/L铁氰化钾0.3ml，线粒体悬浮液0.03ml，0.1mol/L氰化钾0.05ml，用双蒸水补充体积至2.97ml，加入0.1mol/LNADH30μl作为启动剂，在420nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，不加NADH，其余加入试剂均同样品杯。单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟消耗NADH的μmol数。氧化型辅酶Ⅰ的克分子消光系数E420=1.03mmol·L-1·cm-1。1.6线粒体呼吸链酶复合体Ⅱ+Ⅲ的测定〔5〕在样品杯中加入0.2mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液1.5ml，

7、3mmol/LEDTAK0.3ml，0.1mmol/L氧化型Cytc0.1ml，0.1mol/L氰化钾0.05ml，线粒体悬浮液0.03ml，用双蒸水补充体积至2.94ml，加入1mol/L琥珀酸60μl作为启动剂，在550nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，并不加琥珀酸，其余加入试剂均同样品杯。单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟还原Cytc的μmol/L数。线粒体MDA测定按试剂盒(南京建成生物公司)说明。1.7统计学处理所有实验数据应用SPSS11.0软件进行统计学处理，计量结果采用x

8、±s表示，经方差分析后，两组间比较采用t检验，多组间比较采用SNKq检验。2结果2.1电泳和密度扫描分析结果见图1。老年小鼠肝脏中DNA聚合酶γmRNA表达水平较高(0.681±0.013)，黄精多糖各用药组DNA聚合酶γmRNA表达明显降低(0.472±0.006，0.511±0.01，0.574±0.011，均P0.05);黄精多糖各给药组之间差异无统