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《黄斑海蜇蛋白酶解工艺的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、黄斑海靈蛋口酶解丄艺的研究1.实验材料木实验屮所采用的黃斑海蛮购自广西省北海市。将黃斑海蛮用自来水浸泡24小时，不时搅拌并换水，再用流水清洗24小时后，打浆，挤压除水后，以备试验用。DK-S24电热恒温浴锅（上海精宏实验设备有限公司、太仓糟密仪器设备有限公司）；SPECTRAMR酶标仪（DYNEX）；美的微波炉（广州美的微波炉制造有限公司）；FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；氮磷钙测定仪（上海洪纪仪器设备有限公司）。血管紧张素转化酶（ACE）和马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）购自Sigma公
2、司；蒸镭水；0.1mol/LHCl溶液；0.2125mol/LPH8.3buffer；20g/L硼酸；40%NaOH（质量比）；甲基红指示剂。胃蛋片酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶和碱性蛋白酶，购自诺维信生物技术有限公司；帧蛋白I悔，购自南宁东恒华道牛物科技有限公儿其余试剂为分析纯。2.实验方法2.1蛋白含量的测定凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在冇催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机钱盐，然后在碱性条件下将鞍盐转化为氨，随着水蒸气蒸憾并被过量的酸吸收。由于蛋口质含氮量比较恒
3、定，可根据其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。取两支干净的消化管，一支加入黄斑海靈预处理样品1.0015g,另一支不加蛋白粉作为空H对照，其余操作相同。分别加入CuSO4-5H2O0.5g和K2SO43g,加浓硫酸15n）L,在消化炉屮消化1.5h后冷却，固体呈现白色，略混有晶体，将其转移至100mL容量瓶。取锥形瓶加入20g/L的硼酸15mL,滴入2滴甲基红指示剂，并加入5mL样液，lOmLNaOH。将锥形瓶传移至凯氏定氮仪中进行吸收，指示剂变绿色后继续蒸懈10min,将冷凝管尖端提离液
4、面继续蒸镭1mine用0.1mol/LHCL标准液进行滴定，到达滴定终点时锥形瓶中的溶液曲蓝色变成无色，且溶液颜色保持1min不变色，记录此吋试验管和空白管所消耗的HC1标准液的体积。X%=((V1-V2)*N*0.014)/(m*(10/100))*F*100%X：样品中蛋白质的百分含量；VI：样品消耗盐酸标准液的体积，mL；V2：试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mL；N：盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N盐酸标准溶液ImL相当于氮克数；m：样品的质量(体积)，g(mL)；F：有机氮换算为蛋白质的
5、系数。2.2氨基酸组成分析测定按照国标GB/T5009」24・2003测定，黄斑海敌的氨基酸组成。2.2ACE抑制活性的测定取ACE30(1L,样品溶液25(1L(空片溶液用25^iLbuffer缓冲溶液代替)，37°C反应5min后，加入200yL5mmol/L马尿酰组氨酰亮氨酸(HLL),37°C反应60min,加入200yLlmol/L终止反应。反应液中加入1mL乙酸乙酯振荡15s后，取上清液0.8mL,95°C烘干lh后，再加入0.5mL水溶液，228nm测定吸光度。ACE抑制率按照卜•式计算。A
6、-A抑制率(％)=——X100%^hlankAblank是空口对照吸光度；Asample是样品的吸光度。2.4水解用酶的筛选取10g黄斑海蛮处理样品，加入30mL水，按照6种蛋口水解酶(胃蛋白酶,木瓜蛋白酶，风味蛋片酶，碱性蛋片酶，月夷蛋白酶和复合蛋白酶)的最适应酶解条件进行酶解(表1),酶与底物比设定为5%,搅扌米I晦解4h后，开水煮沸10min灭酶，4000rpm/min离心10min,取上清水解液测定ACE抑制活性。表16种蛋白水解酶最适宜的反应条件酶PH温度(°C)胃蛋口酶237木瓜蛋口酶637风
7、味蛋白酶750碱性蛋白酶8.550胰蛋口酶850复合蛋口酶7502.5单因索考察在确定水解用酶的基础上，以ACE抑制活性为指标，考察酶解吋间，酶解温度和酶与底物比(E/S)3个因素对黄斑海蛮酶解产物ACE抑制活性的影响。取黄斑海蛮处理样品10g,加入30mL水，按照E/S为5%,50°C搅拌酶解不同时间(2,3,4,5,6h),开水煮沸10min灭酶，4000rpm/min离心10min,取上清液测定ACE抑制率。取黃斑海蛮处理样10g,加入30mL水，按照E/S为5%,在不同温度下(40,45,50,5
8、5,60°C)搅拌酶解4h,开水煮沸10min灭酶，4000rpm/min离心10mim取上清液测定ACE抑制率。取黄斑海蛮处理样品10g,加入30mL水,按照不同酶与底物比(E/S,3%,4%,5%,6%,7%),50°C搅拌酶解4h后，开水煮沸10min灭酶，4000rpm/min离心10min,取上清液测定ACE抑制率。2.6响应面分析实验在单因素考察的基础上，确定了酶解时间(X/),酶解温度(X2)和E/S(Xj)的考
