附实验实习指导(共享)

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1、附一实验实习指导实习一、动物染色体标本的制备与观察一、实习目的：1.初步掌握动物骨髓染色体标木制备基本过程，了解操作步骤的原理。2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。二、实习原理：凡细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂的任何动物组织，均口J用于染色体分析。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织Z-o给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。三、实验用品1•材料小白鼠、无尾两栖类

2、蛙属或蟾蛛属动物。2.器材水平离心机、显微镜、刻度离心管(10ml)、注射器(1ml)、载玻片、烧杯(400ml)、量筒(100ml)、试管架、银子、剪刀、解剖刀、吸管。3.试剂(1)2%柠檬酸钠溶液：称取2g柠檬酸钠(柠檬酸三钠，Tri-sodiumcitrate,AR)溶解于100ml蒸饴水中。(2)1%柠檬酸钠溶液。(3)500ug/mR100mg/ml秋水仙素(cochicine)溶液。(4)Giemsa(姬姆萨)原液(pH6.8)Giemsa染粉(Giemsastain)lg甘油(丙三醇，glycerine,AR)31ml甲醇(met

3、hylalcoholA,AR)45ml将染粉倾入研钵，加几滴廿油，在研体内研磨直金无颗粒为止，此时再将全部剩余廿油倒入，放入60-65°C保温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶屮备用。(5)0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)Na2HPO4•12H2Oll.Slg(或Na2HPO4•2H2O5.92g)KH2PO44.5g溶缽于蒸憎水屮至1000mlo(6)l:10Giemsa磷酸缓冲液染液(pH6.8)。⑺甲醇(AR)。(8)冰醋酸(Aceticacidglacial,AR)。(9)0.4%KCl(potassiumch

4、loride,AR)溶液。四、实习内容1.小白鼠骨髓细胞染色体的制备方法(1)动物按4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3〜4h后杀死动物。(1)取岀动物后肢的胫骨和股骨。剪去两端。(2)将0.6〜lml2%柠檬酸钠用1ml注射器按上5#针头注入骨髓腔，将骨髓细胞先冲入小碟内，取下注射针头，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入10ml离心管。⑷视骨髓量Z多寡加入0.4%KCl溶液8〜10ml,随即将离心管置37土0.5°C水浴中低渗lOmino(5)以1000r/min离心8min。(6)弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配置的甲醇:冰醋酸(

5、3:1)固定液5ml,加固定液时注意不耍冲动细胞团块。⑺加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻打均匀，静置同定20mino如此反复固定2〜3次，每次20mino(8)固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。(9)在干净、湿、冷的载玻片上滴2〜3滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干(在空气干燥的地方可不用)。(10)将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加l:10Giemsa磷酸盐缓冲液3〜4ml,染色lOmino(11)在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸缓冲液，用小块纱布擦

6、干玻片底面及四周，显微镜观察和分析。1.黑斑蛙或赡赊骨髓细胞染色体标本的制备(1)动物按30ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，7~8h后杀死动物，取出肢股骨和胫骨，用纱布剥掉全部肌肉，剪去胫骨和股骨两部。(2)将lmll%柠檬酸钠溶液用1曲注射器通过5#针头注入骨髓腔，细胞冲入小碟内。(3)摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。(4)将骨髓细胞转入离心管，视骨髓细胞量之多寡加入事先预热至26±0.5°C的0.4%KCl溶液8ml,置26±0.5°C水浴低渗30min。(5)以后的固定、滴片、染色、观察、分析同“小白鼠骨髓细胞染

7、色体的制舍O五、观察1.在低倍镜下观察Giemsa染色之后的中期分裂相的形态。在显微镜下可观察到染色体被染为紫红色。八2•在高倍镜下选择分散适度，不重叠的染色体的分裂相，在油镜下(90X或100X)进行观察六、作业1.记录所观察小口鼠、黑斑蛙或赡赊骨髓细胞染色体的数目和形态。2.绘制染色体图。3•为什么制备小白鼠染色体标本时秋水仙索只注射4ug/g体重，而蛙类需注射30ug/g体重？2.收集小白鼠骨髓细胞用2%柠檬酸钠溶液，而收集蛙类骨髓细胞用1%柠檬酸钠溶液，为什么？实习二、小鼠减数分裂标本的制备与观察一、实习目的本实习是掌握精巢染色体标本制

8、作方法，观察细胞减数分裂过程中不同时期的染色体，了解性细胞形成过程中的染色体状态。二、实习原理减数分裂，是性细胞形成过程中的特殊分裂方式。哺乳动物在性