《生物技术大实验》实验指导书(共享)

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1、《生物技术大实验》实验指导书生物技术教学部常平安舒坤贤谢永芳编重庆邮电学院生物信息学院2005年3月1日《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影

2、响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了

3、加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。由丁分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免

4、有不妥和疏漏之处,恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。编者2005年3月实验一质粒的提取和纯化3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测6实验三PCR产物的TA克隆9实验四感受态大肠杆菌细胞的制备12实验五重组DNA转化大肠杆菌12实验六PCR扩增基因特异片段15实验七DNA片段的回收及纯化19实验八PCR法快速鉴定重组载体22实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒24实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测28实验-1•一RNA的提取及其纯度检测32实验十二逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段35实验十三DNA探针制备38实验十四Southern

5、印迹杂交41实验十五Northem印迹杂交44实验十六荧光原位杂交(FISH)技术47实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测50实验十八生物芯片技术53实验十九RNAi技术56实验二十蛋白质组技术58附录基因工程基本技术路线60实验一质粒的提取和纯化实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离了强度时超螺旋在水相中，开环、线型分了在酚相中进行分离的酸酚

6、法；利用轻基磷灰石在特定的条件.K（8mol/L尿素，0.24mol/L磷酸缓冲液pH=6.8）只吸附双链DNA的軽基磷灰石法（在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链）等。本实验选做的是碱法。1・裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于lOkb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-

7、100等。2.分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。3.纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物

8、质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除