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《毛白杨磷脂酶PtoPLC4的原核表达、纯化及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、毛白杨磷脂酶PtoPLC4的原核表达、纯化及鉴定张杰伟，张中保，陈亚娟，魏建华(北京市农林科学院，北京农业生物技术研究中心，北京100097)摘要：磷酸肌醇特界性磷脂陋C(Phosphoinositide-specificphospholipaseC,P1-PLC)是一类重要的磷酸肌醇信号途径中的酚。将已克隆的磷酸肌醇特并性磷脂酚C基因(PIOPLC4,GeneBankNo.JX861370)的编码区插入到原核表达载体pET28a上，经酶切和测序鉴定，成功获得了读码框止确的磷脂陋C原核表达载体(pET28-PtoPLC4
2、):再将表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导后发现该重组蛋门主要以包涵体的形式存在。采川亲和纯化从町溶性蛋口中纯化到人小为64KD的蛋口条带。Western-Blotting分析亲和纯化所得蛋白可以与His单克隆抗体发生免疫交义反应，表明纯化所得蛋门是PtoPLC4重组蛋白。该结果为进一步研究PtoPLC4的生物学功能奠定了基础。关键词：毛白杨；PtoPLC4；原核表达；蛋白纯化中图分类号：S722Expression,PurificationandIdentificationofPopulus
3、tomentosaphospholipasePtoPLC4inprokaryoteZHANGJiewei,ZHANGZhongbao,CHENYajuan,WEIJianhua(BeijingAgro-BiotechnologyResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097)Abstract:Phosphoinositide-specificphospholipaseC(PI-PLC)isacriticalenzyme
4、inthephospholipidsignalingpathway.ThefulllengthPtoPLC4gene(GeneBankNoJX861370)wasclonedfromPopulustomentosaCaiT.cv"BIHROTsccdlingscDNA,andthenwasconstructedintopET28avectorcontaininghistidine・RecombinantpET28-PtoPLC4plasmidwasobtainedafterdigestionandsequence・The
5、recombinantfiisionproteinwasproducedaftertransformationintoE.coliBL21(DE3)withsubsequentIPTGinduction,anditexistpredominantlyinpelletofcellularextracts.ThefusionproteinwaspurifiedfromthesolublefractionusingacolumnofNi2+ChelatingSepharoseFastFlow,andproofedmolecul
6、armasswas64KD.Theanti-HismonoclonalantibodyrecognizedtheproteinindicatedthatitwasPtoPLC4recombinantprotein.TheseresultswillassistinthestmcturalandfunctionalcharacterizationofPtoPLC4.Keywords:Populustomentosa;PtoPLC4;prokaryoticexpression;proteinpurification0引言磷脂酰
7、肌醇(phosphatidylinositol,ptdlns)是真核生物中--种重要要的磷脂，Ptdins的磷酸化衍牛物统称为磷酸肌醇(PIs)o虽然Pls在真核细胞小仅占磷脂总量的2〜12%,但它不仅是构成细胞膜的基木组分，而冃它木身以及它的裂解产物是细胞与环境进行交流的重要信号分子⑴。现有证据表明动物细胞中Pls及其衍生物在信号转导起重要作用，这些信号转导途径受到诸如牛长因子、激素、神经递质及光等因素的诱导［2］。H前植物屮的PI信号转导途径的相关研究主耍集中在其中主耍的磷脂酶C(PLC)通路上关键酶基因的克隆及其卞
8、理功能的分析。基金项目:北京市科技计划(Z111100066111005)；“十二五”863计划(2011AA100201)作者简介：张杰伟，(1982J,男，助理研究员，主要研究方向：园林分子生物学。通信联系人：魏建华,(1971-),男，研究员，主要研究方向：园林分子生物学。E-mail:weijianhua@b
