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《乳腺干细胞分离鉴定及催乳素对其分化影响的初步研究(0页)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、试验总思路图试验一乳腺细胞的扩增培养试验流程图实验试剂：双抗(青霉素，硫酸链霉素)，上皮生长因子(EGF),二甲基亚矶(DMSO),胎牛血清(FBS),基础培养基DMEM/F12,氢化可的松(HE),转铁蛋白胰岛素(ITS),胰蛋白酶培养液：DMEM/F12+FBS(10%)+EGF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)+IIE(5ug/ml)+TTS(1%)+双抗(lOOunit/ml)冻存液：DMEM/F12(70%)+FBS(20%)+DMS0(10%)实验方法：解冻原代细胞至卡式培养瓶屮，加入3〜5iiil培养液，放入37°C、5.0%C02培养箱中，视培养液情况更换培养液，
2、培养至70〜80%汇合时传至二〜三个卡式瓶,继续培养，当细胞张至70~80汇合时使用0.05%朕蛋白酶一0.025%EDTA溶液消化7〜8min,待有细胞脱离培养皿底吋加入含有10%胎牛血清的基础培养基终止消化。1600rpni/niin离心5min,弃上清液，一部分细胞加入适量冻存液吹打均匀,放入冻存盒中，置于-80°C冰箱中冷冻24h后取出，快速放入液氮中留种备用。另外一部分使用试验二中无血清培养基吹打均匀后进行实验二。实验二乳腺干细胞的筛选UT试验流程图:试验试剂：DMEM/F12,B27,EGF,bFEG,肝素，膜岛素，0.25%胰蛋白酶一0.01%EDTA溶液培养液：DMEM/F1
3、2+B27(2%)+EGF(10ng/ml)+bFGF(10ng/ml)+HE(lOug/ml)+胰岛素(5ug/ml)+双抗(lOOunit/ml)+肝素(4ug/ml)试验方法：利用0.05%朕蛋口酶一0.025%EDTA将实验一中得到的细胞消化成细胞悬液，吹打均匀后使用使用200目细胞筛过滤得到单细胞悬液。将得到的单细胞悬液使用台盘蓝染色计数，将细胞悬液屮细胞密度调整为大于20000个/ml,将细胞悬液加入超低粘附性培养血中，于37°C、5.0%C02培养箱中培养。培养过程中应密切注意观察，除去贴壁细胞及死细胞。100g/min离心更换培养液。死细胞可通过加入DNA酶的方式除去。培养一
4、段吋间后出现细胞团，使用吸胚管将单个细胞团吸至96孔板中，使用0.05%胰蛋白酶一0.025%EDTA溶液消化lOmin得到单-细胞悬液，此吋的单细胞悬液即可视为初步筛选得到的乳腺T细胞。乳腺干细胞通过实验一所用方法大量扩增后冻存和用于进一步实验。实验三乳腺干细胞的诱导分化⑸试验流程图:IV型鼠尾胶原处肌卜皮细筛选后的乳腺干细胞►理过的培养皿f胞诱导液试验a:培养一•段时间后观察是否出现梭形、体积小，有名个细长突起状细胞一
5、上下颠倒数次5。。吶n,心离"聞弃上清一瓷J燥—►加入无酶水—►测定0D值—►反转录为cDNA—►PCR扩增（ul）Mix：12.5引物：］模板:lddH2O：9.5—►
6、1%琼脂糖凝胶电泳检测试验b：试验试剂：DMEM/F12,FBS,EGF,bFGF,胰岛素,氢化可的松,ITS,催乳素,双抗，IV型鼠尾胶原乳腺干细胞诱导为乳腺腺上皮细胞培养液：I)MEM/F12+FBS(10%)+EGF(20ng/ml)+胰岛素(5ug/mL)+氢化可的松(5ug/mL)+ITS(5ug/mL)+催乳素(5ug/mL)+双抗(100IU/ml)乳腺干细胞诱导为乳腺肌上皮细胞培养液：DMEM/F12+FBS(10%)+13—毓基乙醇(0.lmmol/L)+bFGF(20ng/mL)+双抗(100unit/mL)试验方法：试验a：乳腺干细胞诱导分化为肌上皮细胞将实验二分离得到
7、的乳腺干细胞接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上(60mm培养皿屮加入50pig/mL的IV型胶原0.5mL,其它规格的培养血按此比例添加，4°C过夜)，加入诱导分化培养液，放入37°C、5.0%C0?培养箱屮培养。随着试验进行观察细胞形态，拍照记录。细胞出现预期细胞形态而及出现后，加入适量体积的细胞裂解液(Trizol),震荡，使细胞充分裂解，室温静置处理5mino再加入约0.2mL氯仿溶液，剧烈震荡15s,室温静置处理5min,10000g/min,4°C离心15mino此时溶液分为3层，吸取上清约0.5mL,移至新的1.5汕离心管中。加入等体积异丁醇，室温静置20min,10000g/min,
8、4°C离心10min,弃上清。随后加入75%乙醇lmL,混匀,5000r/min,4°C离心10min,弃上清，用75%乙醇再洗一次。室温干燥2~3min,加入适量适量无酶水溶解，并测定0D值。随后，按SuperScriptTTcDNA合成试剂盒说明书进行下一步操作，合成cDNA,RT-PCR反应条件：37°C,15min；85°C,5s；4°Co进行特异基因片段扩增，退火温度需引物合成后t己摸索。1%琼脂糖
