乳腺干细胞分离鉴定及催乳素对其分化影响的初步研究

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1、第一部分乳腺干细胞的分离纯化及鉴定乳腺干细胞的分离、扩增(试验一、试验二)乳腺干细胞的鉴定（试验三、试验四、试验无）第二部分催乳素对乳腺干细胞影响的初步研究催乳素对乳腺干细胞最适作用浓度的确定催乳素受体mRNA的检测不同催乳素浓度作用下乳腺干细胞分化相关基因ck19、β-酪蛋白表达mRNA的检测诱导分化试验a：乳腺干细胞诱导为乳腺肌上皮细胞b．乳腺干细胞诱导分化为乳腺腺上皮细胞试验乳腺干细胞特异性基因鉴定：CD49f、CD29、CD24乳腺干细胞蛋白质水平鉴定试验总思路图试验一乳腺细胞的扩增培养试验流程图冻存的原始细胞放入37℃水中剧烈震动，在一

2、分钟之内使细胞悬液解冻1500rpm/min，5min离心弃上清液培养瓶加入3ml培养液吹打均匀细胞长至培养瓶底部70%~80%汇合吹打均匀-80℃冻存24h后放入液氮冻存0.05%胰蛋白酶—0.025%EDTA溶液处理7~8min加入含有10%血清的普通培养基终止消化1600rpm/min，5min离心弃上清液加入冻存液实验二实验试剂：双抗（青霉素，硫酸链霉素），上皮生长因子（EGF），二甲基亚砜（DMSO），胎牛血清（FBS），基础培养基DMEM/F12，氢化可的松（HE），转铁蛋白胰岛素（ITS）,胰蛋白酶培养液：DMEM/F12＋FBS（

3、10%）＋EGF（20ng/ml）＋bFGF（20ng/ml）＋HE（5ug/ml）＋ITS（1%）＋双抗（100unit/ml）冻存液：DMEM/F12(70%)＋FBS(20%)＋DMSO(10%)实验方法：解冻原代细胞至卡式培养瓶中，加入3~5ml培养液，放入37℃、5.0%CO2培养箱中，视培养液情况更换培养液，培养至70~80%汇合时传至二～三个卡式瓶，继续培养，当细胞张至70~80汇合时使用0.05%胰蛋白酶—0.025%EDTA溶液消化7~8min，待有细胞脱离培养皿底时加入含有10%胎牛血清的基础培养基终止消化。1600rpm/m

4、in离心5min，弃上清液，一部分细胞加入适量冻存液吹打均匀，放入冻存盒中，置于-80℃冰箱中冷冻24h后取出，快速放入液氮中留种备用。另外一部分使用试验二中无血清培养基吹打均匀后进行实验二。实验二乳腺干细胞的筛选[1~4]试验流程图：血球计数板计数台盘蓝染色200目细胞筛过滤细胞悬液使用培养液（无血清）调整细胞悬液中细胞个数大于20000/ml使用吸胚管将乳腺球转移至96孔板加入到超低吸附培养皿中培养出现乳腺球同实验一方法相同，扩大培养，冻存实验一培养基终止消化、继续培养0.05%胰蛋白酶—0.025%EDTA消化7~8min试验试剂：DMEM

5、/F12，B27，EGF，bFEG，肝素，胰岛素，0.25%胰蛋白酶—0.01%EDTA溶液培养液：DMEM/F12＋B27（2%）＋EGF（10ng/ml）＋bFGF（10ng/ml）+HE（10ug/ml）＋胰岛素（5ug/ml）＋双抗（100unit/ml）＋肝素（4ug/ml）试验方法：利用0.05%胰蛋白酶—0.025%EDTA将实验一中得到的细胞消化成细胞悬液，吹打均匀后使用使用200目细胞筛过滤得到单细胞悬液。将得到的单细胞悬液使用台盘蓝染色计数，将细胞悬液中细胞密度调整为大于20000个/ml，将细胞悬液加入超低粘附性培养皿中，于

6、37℃、5.0%CO2培养箱中培养。培养过程中应密切注意观察，除去贴壁细胞及死细胞。100g/min离心更换培养液。死细胞可通过加入DNA酶的方式除去。培养一段时间后出现细胞团，使用吸胚管将单个细胞团吸至96孔板中，使用0.05%胰蛋白酶—0.025%EDTA溶液消化10min得到单细胞悬液，此时的单细胞悬液即可视为初步筛选得到的乳腺干细胞。乳腺干细胞通过实验一所用方法大量扩增后冻存和用于进一步实验。实验三乳腺干细胞的诱导分化[5]试验流程图：培养一段时间后观察是否出现梭形、体积小，有多个细长突起状细胞Ⅳ型鼠尾胶原处理过的培养皿试验a：肌上皮细胞

7、诱导液筛选后的乳腺干细胞加入1/5Trizol体积氯仿溶液室温静置5min加入细胞裂解液（Trizol）吹打充分吸取上清液10000r/min4℃离心15min静置5min剧烈震15s75%乙醇弃上清等体积异丁醇静置20min10000r/min，4℃离心10min室温干燥2~3min5000r/min，4℃离心10min上下颠倒数次1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增（ul）Mix：12.5引物：1模板：1ddH2O：9.5反转录为cDNA测定OD值加入无酶水弃上清换成乳腺腺上皮细胞诱导液普通干细胞培养液培养24hⅣ型鼠尾胶原处理过的培养板试验b：

8、筛选后的乳腺干细胞提取其总RNA，反转录为cDNA检测乳腺细胞分化后表达的特意基因ck19及未分化基因cd29、cd24、cd49f的表