人子宫内膜干细胞的分离、鉴定及诱导分化

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文入子宫内膜干细胞的分离、鉴定及诱导分化Isolation，identificationanddifferentiationofhumanendometrialstemcells课题来源：无专业名称妇产科学学位申请人堂堕墨鍪堕盘：指导教师何援利教授＼答辩委员会主席答辩委员会成员方驰华教授凉翻卅林仲秋教授张晓薇教授疡罗新教授、王沂峰教授巧论文评阅人姚书忠教授彭冬先副教授2012年4月l5日广州硕士学位论文人子宫内膜干细胞的分离、鉴定及诱导分化硕士研究生：张晓露指导教师：何援利教授研究背景摘要干细胞是指在

2、一定条件下具有无限制自我更新和增殖分化能力的一类细胞。按其存在的不同时期可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是存在于各种已分化组织中的未分化细胞。目前已经在多种组织中发现成体干细胞的存在，如神经干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞等。子宫内膜是一个高度活跃的组织，具有很强的自我更新及修复能力，月经、分娩、绝经后激素补充治疗等都能从内膜基底层再生出腺体和基质，形成新的功能层。早在1978年Prianishnikov因子宫内膜具有周期性增殖、分化和脱落的特点而提出存在子宫内膜干细胞的可能，又指出干细胞可能存在于子宫内膜基底层，即在子宫肌层

3、与内膜交界区，从而使功能层内膜增生修复，始而往复。随后有作者在临床实践中又发现，在为功能失调性子宫出血的妇女电切大部分子宫内膜后，内膜还可部分再生，并有妊娠的报道，证明了存在干细胞再生子宫内膜的可能。子宫内膜干细胞是一群具有无限增殖能力的细胞，通过单克隆细胞培养可以从功能上鉴定。单克隆细胞培养主要有软琼脂培养法、有限稀释法、单细胞显微操作法和流式细胞仪分离法等多种方法，其中有限稀释法最常用。其原理是将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度，然后接种于培养板上，培养一段时间后可能出现单个细胞克隆。它与软琼脂培养法、单细胞显微操作法和流式细胞仪

4、分离法等方法比较，具有操作简单，周期较短和费用较低的优点。子宫内膜干细胞为分化未成熟的细胞，不能仅从形态学上将子宫内膜干细摘要胞与其他子宫内膜细胞加以区别，一般多从功能上界定。当然，最好的方法是利用特异识别的组织学和免疫学标志物进行判定干细胞。目前尚未发现其特异性标志物，但有较多文献报道可能的候选标志物有：CD90、CD29、CD73，可能不表达的标志物有：CDl33、CD34、CD45。乙醛脱氢酶(ALDH)是细胞内的一组同工酶，在干细胞分化早期使视黄醇氧化成视黄酸，ALDHl是ALDH家族的主要成员。ALDEFLUOR检测试剂盒

5、提供的不带电荷的ALDH底物(BAAA)fl皂够通过扩散进入活细胞。被细胞内的ALDH转化为带负电荷的反应产物(BAA．)。该产物滞留在具有完整细胞膜的细胞中，使ALDH高表达的细胞呈现明亮的荧光(ALDHmg“)，可以通过流式细胞仪的绿色通道检出。在乳腺组织的正常细胞或癌细胞中，ALDEFLOUR阳性细胞具有类似干细胞的自我更新和多向分化能力，而阴性细胞则无此功能。在造血细胞、胰腺癌和肺癌等多种组织中ALDHl高表达，故ALDHl有望成为分离和鉴别多种干细胞的共同标志。干细胞分化的机理和诱导条件迄今为止还不清楚，大多数人认为干细胞

6、的分化与其所处的微环境“壁龛”密切相关，不同的组织细胞微环境有着不同的细胞因子，可能是诱导干细胞获得靶组织的表型，并向不同细胞谱系分化的主要原因之一。已有研究证实，视网膜细胞培养上清液可以诱导骨髓间充质干细胞向神经元、胶质细胞与视细胞分化。还有研究采用毛囊培养上清液模拟体内的微环境，发现骨髓间充质干细胞具有向毛囊干细胞分化的潜能。因子宫内膜干细胞本身的生物学特性以及方便的取材，使它在组织替代治疗等方面具有广泛的临床应用前景。有试验发现子宫内膜干细胞促进血管生成治疗烧伤，另有科学家在帕金森模型的小鼠体内注入子宫内膜干细胞可以生成多巴胺

7、治疗帕金森病。子宫内膜是胚胎发育的温床，子宫内膜过薄可阻碍受精卵在子宫内膜着床和发育，子宫内膜创伤或感染是导致妇女宫腔粘连和不孕的常见原因之一，其治疗策略最重要的一点是促进子宫内膜再生和功能恢复，而对于重度或广泛的内膜损伤，目前的治疗方法尚难以解决子宫内膜重新再生问Ⅱ硕士学位论文题。另外，子宫内膜干细胞的数量、功能、调控和定位机制的改变也可以引发各种子宫内膜疾病，近年来干细胞应用于临床治疗的研究越来越多。通过对子宫内膜干细胞的研究，可进一步了解、认识子宫内膜的发生、增殖和演变规律，为子宫内膜增殖异常的疾病、子宫内膜的损伤、受孕和胚胎

8、植入、绝经后的激素补充治疗以及肿瘤等多种疾病的预防和治疗，提供了一种新的理念和重要的指导意义。本课题拟于体外分离、培养、鉴定子宫内膜干细胞，并对其进行诱导分化，以证实子宫内膜干细胞的存在性，寻找子宫内膜干细胞可能的标记物，同时探索诱导