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1、生物工程专业实验讲义（适用于生物工程专业）袁丽红曹飞制药与生命科学学院二零零四年四月实验一发酵种子的制备实验二E.coli细胞发酵培养2实验三高速冷冻离心机的使用方法3实验四固定化生物催化剂的制备实验五游离细胞与固定化细胞酶活比较实验六固定化生物催化剂的连续生产6实验七L-Asp的分离7实验八离子交换树脂的预处理及交换容量的测定8实验一发酵种子的制备一、目的要求1.了解实验室种子制备过程。2.掌握实验室不同菌种种子生产方法。二、原理实验室种子制备过程包括琼脂斜而、同体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。不同菌种其具体制备方法不同
2、，其过程如下图：k种子扩大培养过程三、试验及器材1•菌种：斜血低温保藏的大肠杆菌(E.coli)2.培养基：牛肉膏0.5%NaCl0.5%蛋口豚1%PH7.6〜7.8若配固体培养基，在其中加2%琼脂。3.器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶(500mL)四、操作方法1.按培养基配方配制1OOmLpfl体培养基，分装于试管屮。压力1Kg/cm2灭菌30mins,结束后取出、趁热制成斜面。2.按培养基配方配制lOOOrnL液体培养基，分装于三角瓶屮，每瓶100mL,压力1Kg/cm2灭菌30mins,结束后取出。3.挑一环斜面低温
3、保藏的E.coli接于液体培养基中，37°C培养24hso4.挑斜而长好的E.coli约2环接入液体培养基屮，37°C振荡培养24hs,转速约150rpmo五、思考与讨论实验室种子制备的原则是什么？实验二E.coli细胞发酵培养一、目的要求1・了解发酵罐的结构，掌握发酵罐的基木操作技术。2.了解发酵罐中微生物生长的生长特征。3.掌握实验室中微生物从斜面一摇瓶一发酵罐的无菌操作培养技术，对工业化微生物生产过程作出初步了解。4.掌握酶合成代谢调控机制。5.掌握发酵工艺控制工艺。二、原理一定数量的微生物，接种于合适的新鲜培养基中
4、，在适宜的培养条件下，所表现出的群体生长特征可分为四个时期，即延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物在各个时期的生理特征各不相同。微生物的生长过程是其总的代谢活动的综合休现，每一种代谢途径均由一些特有的酶的反应组成，同时微生物代谢具有高度的调节作用，通过本实验了解酶合成的调节机制之酶合成的诱导。三、试剂及器材1.菌种：实验一液体培养24h的E.coli2.发酵培养基：牛肉膏2%、玉米浆2%、KJIPOi0.2%、MgS040.1%富马酸钱0.5%、富马酸钠1%、pH7.5o3.消泡剂：植物油4.器材：发酵罐、灭菌锅、721
5、分光光度计、超净工作台、台式高速离心机、离心管、移液管。四、操作方法1.按配方配制1200mL发酵培养基,调pH7.5,装入发酵罐中,封好各个封口，保持1Kg/cm2压力下灭菌30mins,结束后取出放在超净工作台上。2•待发酵点中的培养基冷却至35°C左右时，用火环接种法将E.coli种了液接发酵器中，接种量10〜15%,控制温度37°C,转速约为300rpm,空气流速lL/min,发酵培养约22〜24hs,其中每间隔lhr取样测pH值和OD660值（样品进行适当稀释）纪录发酵全过程小pH值变化和菌体生长情况。1.发酵结
6、束后放罐、收集发酵液并测量其总体积（V）。吸取1mL发酵液于离心管中，放入台式高速离心机中离心，转速8000rpm,时间10min,测湿菌体重（W，）计算发酵产菌率。五、思考与讨论1•哪些因素影响产菌率。2.如何提高发酵效率。3•讨论酶合成生产的调节方式。实验三高速冷冻离心机的使用方法一、目的要求1.了解高速冰冻离心机的结构、使用方法及注意事项。2.掌握生物物质、微生物菌体离心分离的原理。二、原理离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器，高速冰冻离心机在实验室分离和制备工作中是必不可少的工具，其最高速度口J
7、以达到25000rpm,最大离心力可达89000®这类离心机通常带有冷却离心腔的制冷设备，温度控制是由装在离心腔内的热电偶检测离心腔的温度。高速冰冻离心机冇多个内部可变换的角式或甩平式转头，它们大多用于收集微生物菌种细胞碎片，大的细胞器以及一些沉淀物等。三、试剂与器材E.coli发酵液、天平、Beckmen高速冰冻离心机、离心管四、操作方法1.使用前先检查调速旋钮、定时旋钮等是否在“0”处，离心管是否泄漏。2.选择合适的转头安装到离心腔内承载转头的轴上。3榕诵由湘.打开由湘开关4〕将待离6的液体装只合适矗离心管中，盛量不宜
8、过多（占管的2/3体积）以免益处，盖上离心管盖，精密平衡离心管，并对称的放入转头屮。1.调节速度旋钮和定时旋钮，至所需的速度和时间。2.打开起动开关，并观察离心机上的各个指示仪表是否正常工作。3.离心结束后自动关机、关闭冷冻开关、电源开关、切断电源。4.将转头取出，将离心机的盖了敞开放置。5.收集离心物
