《生物分离技术实验指导及报告》

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1、黑龙江生物科技职业学院生物分离技术实验指导及报告二00五年三月目录【实验一】细胞破碎及梯度离心综合试验1【实验二】用溶剂萃取法提取与精制红霉素4【实验三】牛血清白蛋白在双水相萃取系统中的分配7【实验以】等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白10【实验五】乙醇沉析法提取柑橘皮屮的果胶13【实验六】透析法脱盐17【实验七】硫酸鞍分级盐析分离血清中的主要蛋白质20【实验八】活性炭吸附分离色素实验24【实验九】廿露醇的制备及鉴定27【实验十】胡萝卜素的柱层析分离31【实验十一】离子交换色谱分离混合氨基酸35【实验十二】凝胶柱层析分离蛋白质39【实验一】细胞破碎及梯度离心综合试验得分:【目的要求】1、了解细

2、胞破碎的基本方法，熟练掌握机械破碎法;2、熟练掌握密度梯度离心的原理及方法。【实验原理】1、细胞破碎技术（包括机械破碎法：①捣碎法②珠磨法③高压匀浆法④超声波破碎法；非机械破碎法：①冻结■融化法②渗透压冲击法③有机溶剂法④表面活性剂法⑤酸碱法⑥酶溶法）是捉取分离生物药物的一个基本技术，是学生必须掌握的一项技能。2、溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。在超速离心技术屮,样品的密度应分布在溶液的密度梯度范围内。【实验用品】1、材料土豆、蔗糖。2、试剂O.lmol/L的NaF溶液（将4・2g氟化钠溶于lOOOmL力中）、0.01mol/L的邻苯二酚溶液（将l.lg邻苯二酚溶解于1O

3、OOmL水屮，用稀氢氧化钠调节溶液的pH值为6.0）。3、器具烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、量筒、容量瓶、普通离心机、水浴锅、不锈钢锅。【实验过程】1、酶抽提物的制备：步骤：实际操作及现象：①拿•块土豆，洗去上面的泥土C②去土豆皮后切成小块。③称取50g土豆块放入匀浆器中，再加入氟化钠溶液50mLo④在匀浆器中研磨30s。⑤把匀浆物通过几层细布滤入一个lOOmL的烧杯中。⑥加入等体积的饱和硫酸鞍溶液，混合后于4°C放置30mino⑦在4000r/min下离心15min,倒掉上清液。⑧将沉淀物用大约15mL柠檬酸缓冲液溶解，即得该酶粗制品。2、多酚氧化酶的颜色反应①将3只干净的试管编号为1、2、3

4、O②按下面的要求制备各管：管1：加入15滴酶抽提液和15滴O.Olmol/L的邻苯二酚溶液,混合均匀。管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀。管3：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液和15滴水，混合。③把3只试管放于37°C水浴屮。④每隔5min震荡试管并观察每管屮溶液颜色的变化，共反应25mino现象:3、密度梯度离心(1)梯度的制备先制备出蔗糖不同浓度的溶液，浓度间隔相同(20%,40%,60%,80%),然后每个浓度取相同容量，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。此离心管于20〜25°C静置2〜3h,通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。若

5、用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5〜lh。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴屮备用。(2)密度梯度离心向已成密度梯度的离心管屮加入半滴墨汁，放入离心管屮离心，3000r/min下离心lOmirio现象:【注意事项】1、邻苯二酚溶液应现用现配。2、制备梯度液时要求缓慢，不能使各浓度液混合在一起。【结论】【思考题】1、水果、蔬菜的褐变是否与本实验有相关性?2、密度梯度离心与差速离心的区别?【评语】【实验二】用溶剂萃取法提取与精制红霉素得分:【目的要求】1、掌握溶剂萃取法提取微生物药物的原理和方法2、掌握溶剂萃取法提取微生物药物的步骤和操作要求

6、【实验原理】红霉索可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂屮，在酸性条件下溶于水溶液屮,在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。【实验用品】1、材料2g红霉素软膏2、器材量杯、烧杯、布氏漏斗及配套抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架及铁圈、玻璃棒、银子、剪刀、不锈钢扁匙、PH试纸、滤纸及纺绸布、真空烘箱。3、试剂乙酸、乙酸乙酯（I3A）、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（配制方法：取醋酸钾10g溶于100M于水乙醇中，配成饱和溶液，现用现配）【实验过程】步骤：实际操作及现象：1、取2g红霉索软膏，放入烧杯屮，加6mL乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯调pH值为7.2〜8.0,抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用2、澄

7、清滤液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值为3.5〜6.0,加乙酸丁酯分两次（每次加10〜20mL）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置30min使之分层，用100mL烧杯收集上层萃取液3、取上述下相液，加入一定体积的饱和食盐水，加入乙酸乙酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层丿二将上层広取液（BA液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中。4、结晶与干燥：量取乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上