双向及质谱问题解答

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1、关于双向问题1：凝胶的蛋白鉴定一般需要多少量的蛋白？答：现代质谱和色谱仪的检测灵敏度都是非常高的，只要肉眼能清晰可见（包括银染的点）的蛋白点都可足够进行蛋白鉴定，但是蛋白取点的时候需要注意适当地取大一些的凝胶范围，同时取尽量清晰一些的蛋白点以增加质谱鉴定的成功率。问题2：蛋白溶解液中常用的试剂有哪几种，各是什么作用？蛋白溶解液中常用试剂包括尿素、硫脲、CHAPS、DTT、IPGbuffer等，尿素和硫脲是离液剂（变性剂），高浓度尿素和硫脲能够破坏蛋白质分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集以及蛋白迁移过程中二级结构的形成。CHAPS是两性表面活性剂（去垢剂），可以溶

2、解疏水基团，增强蛋白的在其pI值处的溶解性。IPGbuffer的主要成分是载体两性电解质，具有离子特性，使某些需要在盐离子存在的条件下才能溶解的蛋白保持较好的溶解性。问题3：进行加压主动水化时，电流为零是为什么？一般加压主动水化时，所加电压都很低（50V左右），而凝胶胶条的电阻比较大，导致电流在1uA以下，低于仪器的最小显示值，所以电流显示为零（实际上是有微量电流的），等后续的电压逐渐加大后，其电流也会逐渐加大而得以显示。此外，如果刚开始的电流为零，从另一个角度也说明样品中的离子含量比较低，一般都可以顺利进行后续的等点聚焦过程。问题4：等电聚焦电泳时，为什么会产生一条向酸

3、性端移动的蓝色条带？溴芬兰是常用的颜色显示剂，同时也是一种重要的PH指示剂，在碱性条件下显蓝色，酸性条件下显黄色。在等电聚焦过程中，溶液中的痕量溴芬兰也被聚焦，形成蓝色条带并逐渐向酸性移动，同时颜色逐渐变黄。溴酚蓝的移动大致发生在小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前，可以通过溴芬兰的颜色和移动的效果初步判断等电聚焦效果的好坏。问题5：等电聚焦为什么电压上不去？等电聚焦电压不能上升到指定数值主要是因为样品离子含量过高，导致凝胶导电性强。要解决该问题，一方面可以通过适当修改提取方法及采用滤膜过滤、丙酮沉淀等策略降低样品中的离子含量，另一方面，可以在等电聚焦前的步骤中采用搭盐

4、桥以及缓慢升压的方式除去多余的盐离子。问题6：双向电泳图谱为什么出现横向条纹？一方面要考虑聚焦时间，聚焦不完全和聚焦过度都会产生横条纹，聚焦不完全导致的横条纹比较粗，比较模糊，而聚焦过度导致的横条纹比较细且比较清晰，需要根据胶条长度和PH范围以及上样量选择合适的聚焦时间；另一方面要考虑样品提取，样品中有杂质也会引起横条纹的产生。问题7：双向电泳图谱出现垂直拖尾是什么原因？出现垂直条纹的原因有很多，引起的现象也会有所区别，比如蛋白没有被SDS充分包裹引起的横条纹会在整个区域都出现，适当延长平衡时间以及准确配置各种溶液可以解决该问题；而Tris-HCL的PH值错误也会引起垂直

5、条纹，该条纹呈现下雨状，并且在中上部会有明显的分界线，准确调配PH值可以很好地解决这个问题；此外，样品中含有杂质，比如DNA等也会引起条纹的产生。关于质谱：问题1：凝胶是否可以长期保存？该如何保存？如何运送？答：蛋白凝胶可以长期保存而不影响质谱鉴定效果，一般而言，如果在一两个星期以内，最好用保鲜膜包好，放到4度冰箱保存，如果保存时间超过一个月，可以把蛋白点取下后放入-20度或者-80度冰箱，不会影响后续质谱鉴定效果。运送胶点的时候采用常温运送即可，三五天内都不会有太大的影响。问题2：质谱鉴定取胶点该如何取？有什么注意事项？答：取点的时候将0.2ml的枪头前端剪去一点，用枪

6、头将凝胶戳取下来并转移至0.5ml离心管中，用水将胶粒反复吸打冲洗两至三次，最后吸干离心管中所有水分封盖保存并做好标记。离心管最好用进口离心管，以免塑料污染；水最好用去离子水或者双蒸水；取点的时候带好口罩与手套，以免角蛋白污染。问题3：一级质谱与二级质谱该如何选择？答：一级质谱的鉴定方法又常称为肽指纹图谱鉴定（peptide-massmapping，PMF），二级质谱的鉴定方法又常称为串联质谱鉴定。早期蛋白鉴定，因为考虑鉴定成本的问题，一般做测序生物的蛋白鉴定可以选择一级质谱，而非测序生物常选择二级质谱。现在，二级质谱的价格也大大降低，和一级质谱并无太大差异，而且可靠性和

7、鉴定成功率都大大提高，本公司一般都推荐客户（不管是研究测序生物还是非测序生物）直接做串联质谱，而不考虑进行肽指纹图谱鉴定。问题4：质谱鉴定大致是什么流程，公司一般都提供那些数据？质谱鉴定主要包括蛋白酶解、质谱数据获取、对库检索三个步骤。针对每一个蛋白点的鉴定，一般会提供三种数据，具体包括：质谱图（PDF格式，包括1张一级质谱图和5-10张二级质谱图）、质谱峰列表（text格式，主要是一些质谱碎片的信息）、检索结果（自己建库进行本地化检索的一般提供的PDF格式或者excel格式，如果是Mascot在线检索的一般提供网页格式）。问