第七章基因结构与表达分析的基本策略

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1、第七章基因结构与表达分析的基本策略一、目的要求：掌握:DNA双脱氧末端终止法测序、Southernblot杂交、Northernblot杂交和PCR等技术原理及在因结构与表达分析中的应用；熟悉：Westernblot原理及在特定基因产物-蛋片质分析中的应用。了解：DNA序列测定的原理及其主要应用；RNA酶保护试验原理及应用；原位杂交技术；D7A微阵列技术原理；流式细胞术的应用；免疫组化方法的应用。二、讲授重点:Southern杂交和PCR等技术原理及应用;Northernblot^RT-PCR和Real-timePCR技术原理及应用；West

2、ernblot原理及应用。三、讲授难点：RM酶保护试验原理及应用。四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：第一节DNA序列分析一、双脱氧末端终止法（讲授重点与难点）（一）基本原理1977年，Sanger建立的双脱氧核巷酸末端终止法以DA合成反应为基础ddATPATPdATP5ch2图7-1ATP、dATP和ddATP的结构示意图图72DNA合成反应模式图末端终止法：在DA合成反应体系中，除含有正常脱氧核甘三磷酸底物外,述加入少量的双脱氧核营三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由丁•这种底物的5’-磷酸基团是止常的，能够替代相

3、对应的脱氧核甘三磷酸而与引物延伸链的:T疑基连接，进入部分新合成链；但由于这种特殊底物不存在卽疑基末端，故下一个核甘酸底物不能通过5’-磷酸基团与Z形成3,,5,-磷酸二酯键，从而导致DNA新链的延伸提前终止于这一“异常”核甘酸处，而掺入的双脱氧核甘三磷酸则位于DNA延伸链的最末端(图7-3)然而（二）主要步骤1.单链DNA模板的制备。2.DNA模板与测序引物退火。3.掺入法标记反应。4.延伸-终止反应。TAGCAACTDNA聚合酹T反应C反应G反应A反应dATPdGTPdCTPdTTP+ddTTPdATPdGTPdCTP-^ddCTPdTT

4、PdATPdGTP-^ddGTPdCTPdTTPdATP+ddATPdGTPdCTPdTTP-ATCGTTGddAddA图7-4测序反应的基本原理和过程5.变性聚丙烯酰胺凝胶屯泳。6.放射自显影。7•阅读测序结果。二、化学降解法（自学为主）化学降解法是建立在对原有DXA的化学降解过程基础之上的。（一）基本原理在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一•种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带冇放射性标记的长短不一-的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA

5、片段上的位置。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DXA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的屯泳区带位置。（-）主要步骤1.目的DNA的制备。2.单侧末端标记待测DXA片段。3.碱基的特异性修饰及化学降解。32P-ACACTGAACGTTCATGTCGAI敏腰Mei°32P-ACACTGAACGTTCATGTCGAMet32P-ACACTGAACGTTCATGTCGAMet32P-ACACTGAACGTTCATGTCGAMet32P-ACACTGAACGTTCATGTCGA32c▲cfr-MV/AV132p-acactgaa

6、c32P-ACACTGAACGTTCAT32P-ACACTGAACGTTCATGTC图7-6化学降解G反应模式图4.聚丙烯酰胺凝胶电泳。5•阅读分析结果。图7-7化学降解反应产物电泳区带放射白显彫示意图三、DNA序列分析的自动化（主要了解原理）采用4种带冇不同琥珀酰荧光素标记的终止物ddNTPs,可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。同吋，对DNA序列的识读也在屯泳过程中完成，即当带有某种荧光素标记的单链DNA片段屯泳到激光探头的检测范围时，激光

7、所激发的荧光信号被探测器接收，经计算机分析数据，于记录纸上以红、黑、蓝和绿四种颜色打印出由带有不同荧光素染料标记终止物ddXTPs标示的DNA片段峰谱，继而自动排出DNA序列。第二节核酸分子杂交技术1969年，Pardue等首先建立了细胞原位杂交技术。1975年,SouthernEM建立了检测DNA的SouthernE卩迹杂交技术。1977年，StarkGR建立了检测mRXA的Northern卬迹杂交技术。一、核酸分子杂交的原理核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有二、Southern杂交和PCR等技术可分析g基

8、因拷贝数的变化发现正常人类基因组上存在DNA拷贝数多态性(copynumberpolymorphism,CNP基因或DNA拷贝数的变化对揭示人乙为Southern类