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《引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增（医学论文）》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩【摘要】目的探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HEV）Sgene为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察并分析实验结果。结果降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增，但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率，导致产物量下降甚至得不到产物。结论巢式PCR发生非特异性扩增时，可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。［关键词】巢式PCRHBVSgen
2、e非特异性扩增Abstract:ObjectiveTofindthereasonofcausingnonspecificamplicationinnestedPCRandabateit.MethodsToamplifyHBVSgenebyNestedPCRindifferentprimerconcentrationandannealingtemperatureandobservetheresult.ResultsBothelevatingannealingtemperatureanddecrea
3、singprimerconcentrationcanabatenonspecificamplicationinnestedPCR.ButelevatingannealingtemperaturemayaffecttheamplifyingeffciencythatresulttodecreaseoreliminatethePCRproducts.ConclusionWhennonspecificamplicationhappenedinnestedPCR,bothelevatinganneali
4、ngtemperatureanddecreasingprimerconcentrationcanoptimizethereactionsystem・Keywords:nestedPCR;HBVSgene;nonspecificamplication常规PCR扩增技术应用一对引物扩增目的基因片段，灵敏度和特异性有时达不到实验者的要求。Mullis［1］在常规PCR基础上建立了巢式PCR(nestedPCR)。巢式PCR采用两对PCR引物，进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR,得到的扩增
5、产物作为第2轮PCR的模板，再使用内侧引物进行第2轮PCR扩增目的片段［2］。无论是常规PCR还是巢式PCR,实验者经常会受到非特异性扩增的困扰。从电泳结果上看非特异性扩增表现为与目的片段长度不符的DNA条带或大片弥散状拖带。根据发生机制，非特异性扩增可大致分为两类:第一类非特异性扩增是由引物与模板的非特异性结合引起的，第二类非特异性扩增是由引物与引物之间发生连接引起的。扩增病毒基因组目的片段时，由于病毒基因组内同源性高，使用常规PCR易发生第一类非特异性扩增，即扩增产物为基因组内其他同源片段，
6、而非目的片段。巢式PCR以第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行两轮PCR扩增,从模板方面保证了片段的特异性,ft降低了第一类非特异性扩增的发生机率。并且由于病毒基因组的含量•般都较低，使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，而使用巢式PCR,可通过两轮PCR扩增显著提高产物量,从而达到后续实验的要求［3］。但另一方面，连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，因而增加了发生第二类非特异性扩增的机率，对后续实验造成严
7、重干扰。以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HEV）Sgene［4,5］为模型,分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察它们对非特异性扩增的影响。1材料与方法1.1材料HBV感染者血清由成都医学院第一附属医院感染科提供。1.2主要试剂小量病毒DNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；Taq外侧引物浓度为0.2
8、nmol/L,Mg2+浓度为3mmol/L,dNTP浓度为0.2mmol/L,Taq酶1U;反应条件为:首先949预变性3min,然后94C变性45s,5个退火温度
9、分别复性45s,72°C延伸90s,共循环30次，最后72°C再延伸5mine取第1轮扩增产物2Ml,再用内侧引物进行第2轮PCR扩增，其他反应体系同第1轮；使用4个退火温度分别复性45s,其他反应条件同第1轮。使用1%琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同退火温度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。购自MBI公司；夕卜侧引物PreS2:5’-GGGACACCATATTCTTGG-3与SIR5’-TTAGGGTTTAAATGTATACCCA-3J及内侧引物YS1:5’-GCGGGGTTTTTCT
