引物浓度与退火温度不当导致巢式pcr非特异性扩增

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1、引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增【关键词】巢式PCRHBVSgene非特异性扩增Abstract：ObjectiveTofindthereasonofcausingnonspecificamplicationinnestedPCRandabateit.MethodsToamplifyHBVSgenebyNestedPCRindifferentprimerconcentrationandannealingtemperatureandobservetheresult.ResultsBothelevatingannealingtemperatureanddecreasingpri

2、merconcentrationcanabatenonspecificamplicationinnestedPCR.ButelevatingannealingtemperaturemayaffecttheamplifyingeffciencythatresulttodecreaseoreliminatethePCRproducts.Conclusionullis［1］在常规PCR基础上建立了巢式PCR（nestedPCR）。巢式PCR采用两对PCR引物，进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR，得到的扩增产物作为第2轮PCR的模板，再使用内侧引物进行第2轮PCR扩增目的片段［2］。

3、无论是常规PCR还是巢式PCR，实验者经常会受到非特异性扩增的困扰。从电泳结果上看非特异性扩增表现为与目的片段长度不符的DNA条带或大片弥散状拖带。根据发生机制，非特异性扩增可大致分为两类：第一类非特异性扩增是由引物与模板的非特异性结合引起的，第二类非特异性扩增是由引物与引物之间发生连接引起的。扩增病毒基因组目的片段时，由于病毒基因组内同源性高，使用常规PCR易发生第一类非特异性扩增，即扩增产物为基因组内其他同源片段，而非目的片段。巢式PCR以第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行两轮PCR扩增，从模板方面保证了片段的特异性，降低了第一类非特异性扩增的发生机率。并且由于病毒基因组的含

4、量一般都较低，使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，而使用巢式PCR，可通过两轮PCR扩增显著提高产物量，从而达到后续实验的要求［3］。但另一方面，连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，因而增加了发生第二类非特异性扩增的机率，对后续实验造成严重干扰。以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）Sgene［4,5］为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察它们对非特异性扩增的影响。1材料与方法1.1材料HBV感染者血清由成都医学院第一附属医院感染科提供。1.2主要试剂小量病毒DNA提取试

5、剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；Taq酶购自MBI公司；外侧引物PreS2：5'-GGGACACCATATTCTTGG-3'与S1R：5'-TTAGGGTTTAAATGTATACCCA-3'及内侧引物YS1：5'-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3'与YS2：5'-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3'［5,6］由上海生工合成；电泳级琼脂糖购自西班牙BIOSCIENCE公司；DNA标准品DL2000购自Takara公司。1.3仪器BioRadPCR扩增仪PTC-200；BioRad电泳及凝胶成像系统。1.4方法1.4.1HBVDNA提取采用小量病毒DNA提取试剂盒，按照

6、试剂盒操作说明，以10个HBV感染者血清为材料提取HBVDNA。1.4.2使用不同退火温度组合巢式PCR扩增HBVSgene第1轮PCR反应体积为25μl，反应体系为：1号感染者HBVDNA2μl，外侧引物浓度为0.2μmol/L，Mg2＋浓度为3mmol/L，dNTP浓度为0.2mmol/L，Taq酶1U；反应条件为：首先94℃预变性3min，然后94℃变性45s，5个退火温度分别复性45s，72℃延伸90s，共循环30次，最后72℃再延伸5min。取第1轮扩增产物2μl，再用内侧引物进行第2轮PCR扩增，其他反应体系同第1轮；使用4个退火温度分别复性45s，其他反应条件同第1轮。使用1

7、％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同退火温度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。1.4.3提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响提高两轮的退火温度巢式PCR分别扩增10个HBV感染者的HBVS基因，其他反应体系和反应条件不变。最后使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响。1.4.4使用不同引物浓度组合巢式PCR扩增HBVS基因第1轮PCR分别使用7个外侧引物浓度在60℃退火，其