引物浓度与退火温度不当导致巢式pcr非特异性扩增论文

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1、引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增论文【摘要】目的探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）Sgene为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察并分析实验结果。结果降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增，但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率，导致产物量下降甚至得不到产物。结论巢式PCR发生非特异性扩增时，可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。【关键词】巢式PCRHBVSgene非特异性扩增

2、Abstract：ObjectiveTofindthereasonofcausingnonspecificamplicationinnestedPCRandabateit.MethodsToamplifyHBVSgenebyNestedPCRindifferentprimerconcentrationandannealingtemperatureandobservetheresult.ResultsBothelevatingannealingtemperatureanddecreasingprimerconcent

3、rationcanabatenonspecificamplicationinnestedPCR.ButelevatingannealingtemperaturemayaffecttheamplifyingeffciencythatresulttodecreaseoreliminatethePCRproducts.Conclusionullis［1］在常规PCR基础上建立了巢式PCR（nestedPCR）。巢式PCR采用两对PCR引物，进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR.freelol/L，Mg2＋浓度

4、为3mmol/L，dNTP浓度为0.2mmol/L，Taq酶1U；反应条件为：首先94℃预变性3min，然后94℃变性45s，5个退火温度分别复性45s，72℃延伸90s，共循环30次，最后72℃再延伸5min。取第1轮扩增产物2μl，再用内侧引物进行第2轮PCR扩增，其他反应体系同第1轮；使用4个退火温度分别复性45s，其他反应条件同第1轮。使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同退火温度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。1.4.3提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响提高两轮的退火温度巢式PCR分别扩增

5、10个HBV感染者的HBVS基因，其他反应体系和反应条件不变。最后使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响。1.4.4使用不同引物浓度组合巢式PCR扩增HBVS基因第1轮PCR分别使用7个外侧引物浓度在60℃退火，其他条件反应体系和条件不变。分别取第1轮扩增产物2μl，再用浓度为0.2μmol/L的内侧引物在62℃退火进行第2轮PCR扩增，其他反应体系与条件不变。再取浓度为0.2μmol/L的外侧引物扩增产物，使用7个内侧引物浓度进行第2轮PCR扩增，其他反应条件同上。使用1

6、％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同引物浓度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。1.4.5降低引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响降低外侧引物浓度巢式PCR分别扩增10个HBV感染者的HBVS基因，其他反应体系和反应条件不变。最后使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察降低外侧引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响。注：以上所有PCR反应的阴性对照均以无菌水为模板。2结果与分析2.1退火温度影响巢式PCR非特异性扩增第1轮PCR反应使用5个退火温度：60.3℃、61.7℃、64.3℃、67.5℃与69.3℃，取每个

7、退火温度下得到的产物为模板再使用4个退火温度：61.7℃、64.3℃、67.5℃与69.3℃进行第2轮PCR扩增。电泳结果（图1）表明：第1轮PCR的退火温度在64℃以上或第2轮PCR退火温度在69℃以上就得不到PCR产物了；当第1轮PCR的退火温度在61.7℃时，585bp目的片段上方的大片弥散状非特异性扩增随第2轮PCR退火温度递增而逐渐降低直至消除，提示提高退火温度能减少非特异性扩增。2.2提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响将2轮退火温度分别提高至62℃和65℃，并以60℃和62℃做对照，巢式PCR扩增1

8、0个感染者HBVS基因，观察提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响。电泳结果（图2）表明：提高退火温度虽能消除非特异性扩增，但同时影响了巢式PCR扩增效率导致产物量下降甚至得不到产物。图1退火温度影响巢式PCR非特异性扩增2.3引物浓度影响巢式PCR非特异性扩增根据图1、2，无模板的阴性对照经过2轮PCR扩增也发生了非特异性扩增且比加入了模板时更明显，提示非