欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:14136541
大小:21.65 KB
页数:10页
时间:2018-07-26
《引物浓度与退火温度不当导致巢式pcr非特异性扩增_论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增【摘要】目的探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒(HBV)Sgene为模型,分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察并分析实验结果。结果降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增,但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率,导致产物量下降甚至得不到产物。结论巢式PCR发生非特异性扩增时,可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。【关键词】巢式PCRHBVSgene非特异性
2、扩增Abstract:ObjectiveTofindthereasonofcausingnonspecificamplicationinnestedPCRandabateToamplifyHBVSgenebyNestedPCRindifferentprimerconcentrationandannealingtemperatureandobservetheBothelevatingannealingtemperatureanddecreasingprimerconcentrationcanabatenons
3、pecificamplicationinnestedelevatingannealingtemperaturemayaffecttheamplifyingeffciencythatresulttodecreaseor10/10eliminatethePCRWhennonspecificamplicationhappenedinnestedPCR,bothelevatingannealingtemperatureanddecreasingprimerconcentrationcanoptimizetherea
4、ctionsystem.Keywords:nestedPCR;HBVSgene;nonspecificamplication常规PCR扩增技术应用一对引物扩增目的基因片段,灵敏度和特异性有时达不到实验者的要求。Mullis[1]在常规PCR基础上建立了巢式PCR(nestedPCR)。巢式PCR采用两对PCR引物,进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR,得到的扩增产物作为第2轮PCR的模板,再使用内侧引物进行第2轮PCR扩增目的片段[2]。无论是常规PCR还是巢式PCR,实验者经常会受到非特异性扩
5、增的困扰。从电泳结果上看非特异性扩增表现为与目的片段长度不符的DNA条带或大片弥散状拖带。根据发生机制,非特异性扩增可大致分为两类:第一类非特异性扩增是由引物与模板的非特异性结合引起的,第二类非特异性扩增是由引物与引物之间发生连接引起的。10/10扩增病毒基因组目的片段时,由于病毒基因组内同源性高,使用常规PCR易发生第一类非特异性扩增,即扩增产物为基因组内其他同源片段,而非目的片段。巢式PCR以第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行两轮PCR扩增,从模板方面保证了片段的特异性,降低了第一类非特异性扩
6、增的发生机率。并且由于病毒基因组的含量一般都较低,使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要,而使用巢式PCR,可通过两轮PCR扩增显著提高产物量,从而达到后续实验的要求[3]。但另一方面,连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增,特别在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物,因而增加了发生第二类非特异性扩增的机率,对后续实验造成严重干扰。以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒(HBV)Sgene[4,5]为模型,分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增,观察它们对非特异性
7、扩增的影响。1材料与方法材料HBV感染者血清由成都医学院第一附属医院感染科提供。主要试剂小量病毒DNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司;Taq酶购自MBI公司;外侧引物PreS2:5'-GGGACACCATATTCTTGG-3'与S1R:5'-TTAGGGTTTAAATGTATACCCA-3'及内侧引物YS1:5'-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3'与YS2:5'-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3'[5,6]由上海生工合成;电泳级琼脂糖购自西班牙BIOSCIENCE公司;DNA
8、标准品DL2000购自Takara公司。10/10仪器BioRadPCR扩增仪PTC-200;BioRad电泳及凝胶成像系统。方法HBVDNA提取采用小量病毒DNA提取试剂盒,按照试剂盒操作说明,以10个HBV感染者血清为材料提取HBVDNA。使用不同退火温度组合巢式PCR扩增HBVSgene第1轮PCR反应体积为25μl,反应体系为:1号感染者HBVDNA2μl,外侧引物浓度为μmol/L,Mg2+浓度为3mm
此文档下载收益归作者所有