临床诊断中的实时PCR技术

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1、临床诊断中的实时PCR技术杜秀敏齐法莲徐军克丙申济南军区总医院实验诊断科250031冃前，DNA分析技术已被广泛的应用于临床，包括分子遗传学、肿瘤学、微生物学、血液学及免疫学，其中许多技术依赖于靶分了的PCR扩增及扩增后分析，如限制性酶切与凝胶电泳以检测特升性扩增片段。这种定性检测重复性差，町靠性低，易给临床诊断带来混乱，阳实时PCR的出现实现了DNA的定量分析，明显提高了诊断的特异性、灵敏度，快速、简单、自动、有效。有多种反应平台町以完成实时PCR分析，如RocheLightCycler、ABIPrism7700、PE5700和超速热循环仪等。1实时PCR的生化特征

2、冃前，许多实时PCR技术都基于同样的原理：即每产生一分了靶DNA即产生一个信号分了的改变，肖足量的靶基因通过检测系统时就会产牛信号的积累从而被检测。检测扩增过程的技术包括非特界性双链DNA染色和特片性探针杂交系统。1.1非特异性检测染料（如SYBRGreen1）结合到双链DNA上时能够产生很强的荧光信号。在PCR过程中，当染料结合到新合成的DNA分子上时，产生的递增信号就会被实时检测。当扩增反应完成时，通过缓慢加温双链DNA解链，结合其上的染料脱落导致信号下降从而被检测⑴。由于反应中每类DNA都有其特征性融链过程，从而可以提高检测结果的可靠性。但其主要缺点在于染料非特

3、界地结合双链DNA,并不能区分引物二聚体及非特界性扩增产物，故应优化检测条件以降低扩增产物的非特界性。1.2特异性探针杂交系统许多探针检测系统依赖于信号产生过程中荧光素介导的能最传递（FRET）,FRET包括能量从一个供体分了到受体分了的非递减性能量传递，能量传递的效率与DxlO6成比例，D是供受体分子之间的距离。英它探针系统，如TaqnKm探针、分子信标与Scorpion™引物等，则依赖探针在游离状态下报告荧光基团与淬灭分了的接近使其荧光淬灭。当探针杂交到靶分了上时，由于杂交时的构型变化或Taq聚合酶的5'核酸外切酶活性，报告基团的荧光素游离出来产生信号的增加。Ta

4、qman探针系统包含一个探针序列，其两端各标记一个荧光素分了及淬灭分了。在PCR过程中，当探针杂交到靶序列上时，Taq聚合彌5'->3'外切陆活性剪去探针，继而荧光素与淬灭分子分离产牛荧光信号的增加。分子信标与Scorpion引物都包含一个发夹结构的探针序列（探针5'和3'互补），探针在游离状态下其5'的荧光素分了和3,的淬灭分了很接近。当杂交到靶序列上时，茎环结构张开，荧光素与淬火分子分离产生信号的增强，研究表明，分子信标由于具有茎环结构而比Taqman探针具有更高的特异性⑵。2实时PCR的临床应用作者简介：杜秀敬，女，硕士，现在济南军区总医院实验诊断科工作。Tel

5、:（0531）21669172.1基因型检测FRET探针被川來检测a・抗胰蛋口酶抗体等位基因Pi*Z与Pi*S⑶，50多个个体彼鉴定耳所有基因型与PCR限制性片段长度多态性分析所得的结果相一致。同样的方法用来分析凝血酶原突变与人类血小板抗原棊因等〔处〕。Taqman探针检测系统是冃前所冇实时PCR中授成熟的技术，它在基I大1变杲检测方面的应用己有广泛报道，鮫近的如检测凝血酶原及亚甲四氢叶酸酯(MTHFR)棊因突变⑹。Taqman探针结合等位基因特异性引物可用來检测药物代谢酶类的多态性与HLA-DRB等位基因⑺。借助于ABI7700,分子信标己被用来检测MTHFR基因中

6、C677T突变，Scorpion引物被用做检测五个常'见的囊纤维化基因突变子冈。运川PE5700软件，SYBRGreen1与PCR产物的结合能够定量线粒体DNA(mtDNA)叨。2.2病原菌检测FRET探针与LightCyclei•被用于水痘一带状疱疹和疱疹单一病毒粒子检测〔叫其灵嫩度高于培养分析法。Taqman探针系统被川于流感病毒的分型及脑膜炎双球菌DNA的检测，具灵敏度与特异性均高于培养分析法〔⑴。利用Taqman探针系统与ABI7700检测慢性HBV感染病人中HBV粒子，其分析范围可达每毫升标本373-1010基因组拷贝，且室间与室内Ct的CV值分别为1.65

7、%和1.85%l，2,o在HBV的研究中，Taqman法被认为是具有高度重复性与灵俶度的，标本中只要每毫升含有IO."病毒拷贝就可被精确检测〔四。2.3定量mRNA传统方法的灵敏度均达不到检测低表达mRNA的要求，因一些编码受体和内部信息分了的mRNA拷贝数极低，只能用定量逆转录(QRT)PCR方法，通过在不同反应管中加入内标，控制RT-PCR的扩增效率才能精确测定mRNA水平网。早在1988年Rappolce等人就将此法用于TGF-amRNA表达水平分析。2.4肿瘤研究Cairns等〔⑴在考察原发性膀胱癌中，用定量PCR检测P“(DPS1752)的