细胞培养技术第一章绪论和基本理论

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1、细胞培养技术1第一章绪论和基本理论知识第一节绪论一、体外培养（InVitroculture）1、概念：将活体结构成分甚或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：组织（多指组织块）2、结构成分：细胞培养：单个细胞或细胞群器官培养：器官的原基、器官的一部分或整个器官2第二节生存环境、条件一、无污染环境：首要条件二、温度36.5℃±0.5℃（36℃~37℃）三、气体环境和氢离子溶度95%空气+5%CO2pH值为7.2~7.4四、生存所需基本物质（一）糖；（二）氨基酸；（三）促生长因子；（四）其它物质五、渗透压：260~320mOsm/kg（等渗）六

2、、培养基：天然培养基和合成培养基3第二节无菌操作设施和工作间一、净化工作台（supercleanbench）测流式、直流式和外流式二、无菌操作室：更衣间、缓冲间和操作间三、清洗和准备区：洗涤间，洗刷、浸酸、消毒、蒸馏水五、温育和贮存区：温箱、冰箱、干热箱、液氮罐六、观察区：摄影器材、倒置显微镜第二章设施和基本条件第一节实验室设计4第三节实验室设备一、CO2培养箱：5%CO2，T36.5℃±0.5℃二、电热干燥箱：烘干和干热消毒（60℃）三、冰箱：培养用的溶液，4℃、–20℃和–80℃四、显微镜五、水纯化装置六、过滤除菌装置（1）Zeiss滤器（2）玻璃漏斗式滤器（3）微孔滤膜滤器5

3、七、细胞冷冻储存器：液氮罐、–80℃超低温冰箱八、离心机、天平、电动吸液器和加样器九、细胞计数板和电子细胞计数仪十、pH计十二、高压蒸汽消毒装置十三、其它仪器6第四节器械及培养器皿常用的器械：手术剪、虹膜剪、镊子、止血钳等。一、玻璃器皿：（1）玻璃瓶（2）培养瓶（3）培养皿（4）吸管和吹打管（5）离心管二、塑料瓶皿：多孔培养板；培养皿；培养瓶；7第三章培养用液第一节水和平衡盐溶液一、水：二蒸水、三蒸水二、BSS：Ringer液、PBS液、D-Hanks液和Hanks液第二节天然培养基—血清一、种类：人血清和动物血清（牛、马、猪、兔）二、血清中成分：蛋白质、多肽、激素和其它成分。8第

4、三节合成培养基三、使用前处理：56℃水浴灭活30分钟四、保存：灭活的血清保存于4℃中；未灭活的血清保存在-20℃冰箱中。一、合成培养基的种类1、MEMEngle培养液2、DMEM：高糖型和低糖型3、RPMI16404、M1999二、合成培养液的配制（一）培养液的制备用干粉制备培养液的过程如下：（1）制备去离子水（玻璃三蒸水）；（2）加温水至15~30℃；（3）把干粉加入水中，搅拌令之溶解；（4）加NaHCO3；（5）加水至终量；（6）必要时用1NHCl或1NNaOH调节pH；（7）用0.22μm或小于此微孔滤膜滤过消毒。10（二）培养液的种类基本培养基血清生长培养液80~90%10

5、~20%维持液95%2~5%第四节其它溶液一、消化液：胰蛋白酶溶液0.25%或0.125%；0.02%EDTA（Versene）溶液11二、pH调整液1.NaCO3液：7.4%、5.6%、3.7%2.HEPES（分子量238.31）液三、抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素第四章清洗与消毒一、玻璃器皿的清洗（一）浸泡（二）刷洗（三）浸酸:24h12类型重铬酸钾浓硫酸蒸馏水（g）（ml）（ml）强液631000200次强液1202001000弱液100100100不同的强度清洗液（四）冲洗13二、胶塞的清洗三、塑料器皿的清洗四、包装（1）局部包装：较大的瓶皿、滤器，消毒筒等只

6、把瓶口部分用硫酸纸包裹后，再罩以牛皮纸或棉布密包起来用线扎紧即可。（2）全包装：比较小的培养皿、注射器、金属器械和胶塞等需采用全包装，现多包入铝饭盒。14第二节消毒一、物理消毒法1.射线消毒法：60Co、X射线和加速器2.干热消毒法：160℃保持60分钟3.湿热消毒（高压蒸汽消毒）：15磅20分钟4.滤过消毒：Zeiss滤器、微孔滤膜器二、化学消毒法：来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸和75%酒精三、抗生素消毒法15第五章基本培养技术第一节组织培养的基本操作和培养技术一、培养操作基本要领和要求（一）无菌操作1.操作野消毒：紫外线灯30~50分钟（工作台）2.洗手和着装：75%酒精3.火焰消

7、毒：酒精灯或煤气灯二、基本培养操作技术（一）组织的分离161.离心分离法：全血淋巴细胞分离2.机械分离法：切割分离法；机械分离法3.消化分离法（Tripsin）：（1）胰蛋白酶：0.25%浓度，多用于消化传代细胞（2）弹性蛋白酶（Elastase）：消化纤维蛋白、弹性纤维（3）胶原酶（Collagenase）：胶原纤维（4）链霉蛋白酶E（PronaseE）：（5）EDTA消化液：0.02%，消化传代细胞17（二）细胞冻存和复苏低温液氮冷冻贮存：-196℃1.原理：10