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《用巢式pcr扩增zfy基因产前诊断胎儿性别》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别近年來的研究表明，Y染色体上锌指结构基因(zinc-finger-Ygene,ZFY)是继SRY之后乂一与性分化有关的单拷贝基因，并与粕子的发生有关［1'21o为此，我们利用巢式PCR技术，以ZFY作为检测指标，参考有关文献口行设计内外两侧两对巢式PCR引物［3］,对绒毛、羊水和孕妇外周血标本进行ZFY基因的特异扩增，初步建立了一种用PCR技术产前检测胎儿性别的方法。1材料与方法1.1标本取正常男、女外周血各20份，每份0.5mlo孕10〜32周妇女外周血31份，每份
2、6ml,流产胎儿绒毛45份，羊水40份，均为木科收治患者。分别采用绒毛染色体核型、羊水染色体核型、引产和岀生胎儿生殖器检查确定胎儿实际性别。1.2模板DNA的提取1.2.1外周血细胞DNA的提取(1)将6mlEDTA抗凝血离心5000r/minX3分钟后弃血清；(2)加入等体积破红细胞液(0.32mol/L蔗糖,10minol/LTris-HCl(pH7.5),5minol/LCaCl2,l%tritonX-100)充分裂解红细胞,离心5000r/minX3分钟，重复2次;(3)沉淀物加100u1白细胞裂解液
3、(50mmol/LKC1,10mmol/LTris-IICl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,0.1%明胶,0.5%NP40)混匀后加入蛋白酶K5ul(30mg/ml),置50°C消化2小吋，95°C加热10分钟，置-20°C保存备检。1.2.2绒毛及羊水DNA提取参考文献［4］的方法，所有标本均进行巢式PCR扩增，随机取20例绒毛标木进行斑点杂交。1.3ZFY基因的引物设计及扩增根据ZFY全基因序列，G+C比例和次级结构设计的巢式PCR实验用的外侧特异性引物选在ZFY基因区2125-2145位及
4、2458〜2478位,引物序列分别为P1：5’-CCATTTGTTCTAAGTCGCCA-37,P2：5’-CTTCAAGGCCAACATCAGCTG-3z,扩增产物长354bPo内侧特异性引物选在ZFY基因区2149〜2169位及2435〜2455位，引物序列分别为：P3：5’-CTCTCAGT-TCACACAAAGG-37,P4：5’-GCTTGTA-GACACACTGTTAGG-37,扩增产物长307bpo上述引物经计算机模拟核酸杂交软件辅助分析与美国GeneBank基因数据库比较表明，与人体基因组和其
5、它生物基因组无明显同源性，引物碱基与靶基因一致，自身无发卡结构，无互补结构。PCR条件参数见木实验室已建立的HPV-PCR试验C5］o1.4斑点杂交样品配制:DNA液20U1,0.4mol/LNaOH,20u1,20XSCC40u1,混匀后加样于硝酸纤维素薄膜上，使用PCR扩增片段内一段特异性寡核背酸作探针，探针序列为：TTCATACAAA-AGACTATCCTCATCGGTG,探针标记采用随机引物法，杂交步骤参见文献［4］的方法。2结果2.1扩增片段的序列分析用1・5%低溶点琼脂糖凝胶回收354bp和307
6、bp扩增片段,经Scphaglasbandprepkit抽提后，乙醇沉淀干燥，参照SequiThermTM循环测序试剂盒说明进行Sanger双脱氧终止法“直接序列测定”⑹，测序引物为PCR引物。测序反应产物经SephedexG-75离心层析柱纯化后，在Bio-radDMA序列仪上，以6%聚丙烯酰胺凝胶，50°C50W电泳，-20°C放射自显彩24小时。测序的自显彩结果如图1所示。图1ZFY基因PCR产物纯化后直接核酸序列分析的放射自显影图结果所测得序列与文献报道完全一致。ZFY基因354bp及307bp扩增片
7、段核酸序列：TATT-CTCTCAGTTCACACAAAGGATCTT・CCATTTAGGTGTAAGAGATGTAG-AAAGGGATTTAGGCAACAAAATG・AGCTTAAAAAGCATATGAAGACAC-ACAGTGGCAGGAAAGTATATCAGT・GTGAGTACTGTGAGTATAGCACTA-CAGATGCCTCAGGCTTTAAACGGC・ACGTTATTTCCATTCATACAAAAG^ACTATCCTCATCGGTGTGAGTACT-GCAAGAAAGGCTTCCGAAGACCT
8、T・CAGAAAAGAACCAGCACATAATGA-GACACCATAAAGAAGTTGGTCTGG-:EpN匸■■■*GATTGTCACACAGATGTTCGTTCG-TCGACTACAACCGGAACTTC（虚线为巢式PCR外侧1对引物,实线为巢式PCR内侧1对引物）2.2PCR特异性及敏感性实验20例止常男性用内外侧引物均有扩增带，而女性均无扩增条带；45例绒毛标木中，21例有特异性扩増带，
