致病性菌检测方法-国家标准

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1、大肠杆菌检测方法一、检测流程图稀释液（1：10）10ml10ml双倍乳糖胆盐培养基44±0.5℃24-48h不产酸不产气产酸产气划线伊红美蓝1-2滴到蛋白胨水37℃18-24h44±0.5℃24h*典型菌落无典型菌落加靛基质试剂0.5ml革兰氏镜检阳性：玫瑰红色阴性：试剂本色阴性短杆菌非阴性短杆菌粪大肠杆菌注：（1）代表非粪大肠杆菌，没必要在进行下一步鉴定。（2）典型菌落：深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，具有金属光泽。也有呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。二、培养基和试剂1.双倍乳糖胆盐培养基（货号：022041，厂家：广东环

2、凯微生物科技有限公司）称取60g到1L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到带有小倒管的试管，115℃高压灭菌20min。2.伊红美蓝培养基（货号：022060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取37.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，121℃高压灭菌15min。3.蛋白胨水（货号：022110，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取25g到1L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到试管，121℃高压灭菌15min。4.靛基质试剂柯凡克试剂：5g对二甲氨基苯甲醛溶于75ml戊醇，缓慢加入浓盐酸25ml。5.革兰氏染色1）染液制备结晶紫染色液，革兰

3、氏碘液，脱色液（95%乙醇），复染液（沙黄复染液/稀石碳酸复红液）2）染色法A将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。B滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。C滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。D滴加复染液，复燃1min，水洗，待干，镜检。3）染色结果革兰氏阳性呈紫色，革兰氏阴性呈红色。铜绿假单胞杆菌检测方法一、检测流程图薄菌膜，培养液黄绿色或蓝绿色无薄菌膜，培养液非黄绿色或蓝绿色*典型菌落无典型菌落90mlSCDLP（*增菌培养）37℃，18-24h革兰氏染色*氧化酶试验*

4、绿脓菌素试验*硝酸盐还原产气试验*明胶液化试验*42℃生长试验阳性：粉红色/紫红色阴性：凝固不溶阳性阴性阴性阴性阳性：粉红色/紫红色阴性:无气阳性：产气阳性：粉红色/紫红色阴性：不生长阳性：生长稀释液（1：10）10ml十六烷基三甲基溴化铵培养基37℃，18-24h注：（1）代表非铜绿假单胞杆菌，没必要在进行下一步鉴定。（2）典型菌落：扁平无定形，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。（3）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在滤纸上。滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试剂，在

5、15s-30s之内出现粉红色或紫红色为阳性，阴性不变色。（4）绿脓菌素试验：取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3-5ml，充分振荡是培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿内，待提取液为蓝色时，将其转移到试管并加入1mol/L盐酸1ml，振荡，静置。上层盐酸出现粉红色到紫红色为阳性。（5）硝酸盐还原产气试验：取可疑菌落，接种硝酸盐蛋白胨水培养基，37℃培养24h。小倒管有气体为阳性。（6）明胶液化试验：取可疑菌落，穿刺接种在明胶培养基，37℃培养24h后，放冰箱10-30min，阳性呈溶解状，阴性为凝固不溶。（7）42℃生

6、长实验：取可疑菌落接种普通培养基，41-42℃培养24-48h，若能生长为阳性，不生长为阴性。二、培养基和试剂1.SCDLP液体培养基（货号：027010，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取38g到1L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装量90ml，121℃高压灭菌20min。2.十六烷基三甲基溴化铵培养基（货号：027040，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取33.3g到1L蒸馏水或去离子水，115℃高压灭菌20min。3.绿脓菌素测定用培养基（货号：027050，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取46.4g到1L蒸馏水或去离子水，再加1

7、0g甘油，加热搅拌完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20min。放置成斜面。4.硝酸盐蛋白胨水培养基（货号：027060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取15.5g到1L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到带有小倒管的试管，115℃高压灭菌20min。5.明胶培养基（货号：022250，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取128g到1L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装试管（60-75mm），115℃高压灭菌20min。垂直放置待其凝固。6.营养琼脂培养基（货号：022020，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）称取33g到1L蒸馏水或

8、去离子水，121℃高压灭菌15min。金黄色葡萄球菌检测方法稀释液