（精品）论文翻译

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1、2009年7刀AEM接收，网上发表。Appl.Environ.Microbiol.Doi:10.1128/AEM.00648-09版权所有：美国社会微生物、所列作者、机构。利用土壤根癌农杆菌介导转化的方法对产汕真菌——高山被他霉1S-4的构建以及该方法在产二十碳五烯酸菌种方面的应用作者:AkinoriAndo等机构：京都农业人学研究牛院应用牛命科学系等通讯作者通讯地址：口木东京农业大学研究生院应用生命科学系电话:81757536122传真:81757536128电子邮件：sim@kais.kyoto-u.ac.jp基因操作技术在

2、产花生四烯酸的高山被抱霉1S-4菌的冇效利用方面得到了冇效发展。在我们的研究屮根瘤农杆菌介导法（ATMT）被研究用来作为高山被孑包霉1S-4的转化，具体来说是用高山被砲霉的尿II密吸缺陷性菌株作为受体细胞，同源的基因作为选择性的标记基因。不尽如此，通过根瘤农杆菌介导法提高了omega-3脱氢酶在n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸方而的过表达。根据转化结果我们知道，该方法的转化率已经超过了40（）个转化了/1（卢个砲子，大多数的综合T-DNA在染色体的DNA的任意位置作为单复制了进行表达，并且人多数（60%・80%）的转化子表现出稳定

3、的冇丝分裂。并且我们检测到转化子的m3脂肪酸的农达量在omega-3脱氢酶基因的最佳表达量的范围内。特别需要强调的：EPA（m3系列脂肪酸合成的最终物质）的表达量达到了高山被他每产油总量的40%o有上述实验我们可以得出这样的结论：农杆菌介导法是对于生成高山被抱霉的商业化菌株是有效并且合适的。这种方法将对我们的基础研究以及工业化菌株的发现是很有用的。20年以前，我们实验室从油里分离出來一株有可能产多不饱和脂肪的丝状真菌一一高山被抱霉1S-4,我们把这种丝状真菌作为牛产商业化的花牛四烯酸。该菌株的突变体町以川來生产DGLA以及MAo

4、由于其他的多不饱和脂肪具有来源限制以及很高的商业价值，所以我们尝试着改造高山被砲霉使它生产英他的多不饱和脂肪。特别是改造它，使得它可以生产n-3多不饱和脂肪，现在n-3多不饱和脂肪的来源主要是鱼油，所以很有必要来找到n-3脂肪酸的稳定的來源并提高其质量。但是，利丿IJ突变进行生物合成脂肪酸的方法冇很多缺点，例如：突变产牛的菌株在脂肪酸合成的特定的酶的活性很低，并且对于工业生产来说是不适合的。并11针对脂肪酸代谢的途径的基因操作工具也没有被很有效的开发。并11,基因操纵做为一种新的分了育种方法，可以用来分析菌种的生理学性能证明多不

5、饱和脂肪酸的生物介成途径。针对真菌的一种综合的转化系统已经基木建立成功。这是日前为止唯-一种行之冇效的方法，貝体來说是用高山被砲霉的尿I密旋缺陷性菌株做为受体，基因作为选择标记基因，整个实验通过启动子的方法进行转化。农杆菌介导法已经被广泛的应用在植物领域。近年来的报道表示：农杆菌介导法也可以把DNA转移到多种真菌、植物。这种杆菌在原生质体的状态下可以转化细胞和砲子。山于在口然状态卜-农杆菌系统产生了大量稳定的转化子，这些转化子都表现出了很强的生长活性,所以说农杆菌介导法僵尸高山被抱霉分子操作的有力工具。并「L,相应的转化效率耍比

6、传统的转化方法要高。在我们的研究中，我们评价了利川农杆菌介导法转化外源基因的转化效率并找到了最佳的转化条件。我们利用农杆菌介导法，使得一•株商业用途的n-6高山被抱霉菌株过表达omega-3脱氢酶来捉高n-3多不饱和脂肪酸的产量。材料和方法：陆和化学药品：限制陆和•其他DNA-修饰腮是从口本TakaraBioInc公司以及美国的NewEnglandBioLabs购买的。用來共培养的硝化纤维膜（直径为70mm,可以阻止50等价人的灰尘）是从英国的Whatman公司购买的。NileblueA是从Sigma公司购买的。所有的化学品都是

7、分析等级的。菌种和牛长条件：我们用PDA（土豆琼脂培养基）以上傲述获得的突变体高山被胞霉被作为转化的受体。对于质粒构建来说，我们在合适的条件下培养大肠杆菌DH5a菌株，该菌株被在含有50ug/ml的氨节的LB培养基上培养。农杆菌C58C1以及质粒pBIG2RHPH2是有YasuyukiKubo博士提供的。这株菌的作用是提供高山被抱霉转化过程屮的T・DNA。Czapek-Dox以及SC琼脂培养基已经在前面叙述过了。Czapek-Dox琼脂方法补充0.05mg/ml尿i密呢之后用來作为ura・5菌株的砲子。SC培养基或者是没有尿I密

8、呢的被用來培养培养含有ura・5的高山被抱霉以及它的转化子。GY培养基（2%葡萄糖w/v、1%酵母提取液）被用来作为液体培养，用来提DNA的菌株需要用其他配方（2%的匍萄糖、3%的酵母提取液）。所有的转化子的液体培养都是在125转/min、28度的条件下进行的。