吡格列酮通过蛋白对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制的研究

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1、毗格列酮通过p—CREB蛋白对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制的研究摘要：目的通过检测大鼠心肌缺血再灌注p-CREB蛋白表达的变化，探讨毗格列酮对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护机制。方法将55只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、毗格列酮组、毗格列酮+GW9662组，左前降支结扎的方法建立缺血再灌注损伤模型，伊文思蓝染色测定心肌梗死面积，Westernblot法测定心肌组织p-CREB蛋白表达。结果毗格列酮组梗死面积与缺血再灌注组比较明显减少(P0.05)；与毗格列酮组相比，毗格列酮+GW9662组p-CREB蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论毗格列酮可能上调p-CR

2、EB蛋白表达进而抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤，GW9662可逆转毗格列酮对心肌细胞的保护作用。关键词：缺血■再灌注损伤；卩比格列酮；p-CREB蛋白中图分类号：R542.2R256.2文献标识码：A随着临床上对于急性冠脉综合征的溶栓、介入、冠状动脉搭桥等治疗的广泛应用，使冠心病的治疗进入再灌注时期，冠状动脉再通后都将直接面临心肌缺血再灌注损伤(MIRI)等重大的临床问题。研究发现细胞凋亡在细胞再灌注损伤中发挥重要作用，抗凋亡机制可能是减轻再灌注损伤的新方法。既往发现卩塞呼烷二酮类药物对缺血再灌注损伤有保护作用，主要是减轻心肌细胞凋亡口，2]oCREB是环腺昔酸（cyclicade

3、nosinemonophosphate,cAMP）应答元件结合蛋白的简称，对细胞的增殖、再生起重要的作用。最初发现CREB与学习及记忆功能有密切关系，近年研究显示P-CREB对循环系统也发挥重要作用[3]o但关于毗格列酮在缺血再灌注时p-CREB蛋白表达的影响报道较少。本实验在原有研究基础上，观察过氧化物酶体增殖物激活受体-r（peroxisomeproliferators-activatedreceptor-r,PPARr）激活剂毗格列酮对大鼠缺血再灌注（I/R）心肌p-CREB蛋白表达的影响，以进一步探讨毗格列酮抗缺血再灌注损伤的分子机制。1材料与方法1.1主要药品和试剂盐酸毗格

4、列酮片由日本武田药品工业株式会社生产；GW9662由Pfizer辉瑞公司生产；伊文思蓝由江莱生物公司生产；环磷酸腺昔（cAMP）反应元件结合蛋白一抗由CellSignal公司生产。1.2实验动物及分组健康雄性SD大鼠55只，体重250g〜300g,山西医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分成4组。假手术组（10只）：生理盐水2mL/d灌胃；缺血再灌注组（15只）：生理盐水2mL/d灌胃；毗格列酮组（15只）：毗格列S®mg/（kg?d）灌胃；卩比格列酮1氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）特异性阻断釧V9662组（毗格列酮GW9662组,15只）:毗格列酮Img/（kg?d）灌胃，

5、缺血再灌注前30min静脉注射GW9662o各组灌胃2周后制作大鼠在体心肌I/R模型。假手术组只开胸穿线，不结扎冠状动脉。1.3方法1.3.1模型建立［4］腹腔注射40%水合氯醛麻醉大鼠（3mL/kg）,心电图监测。切开气管进行插管，tt1：2,通气频喲次/min。暴露心脏后在冠状动脉榔1mm〜2mm处用晞0线的眼科针穿过肺动脉窦和左心建间垫一塑料管后用止血钳夹紧，观察左室前壁心肌極及心电图动态演变。心肌组织题变瞌心电图ST段抬高或下降,判断为结扎成功缺血30min后放松结扎部位，使冠状动脉再通120mine再灌完成后剪下心脏，液氮冷冻心室前壁留取的组织，检测心肌梗死面积及提取蛋白质

6、假手术组只穿线但不结扎冠状动脉，暴露心脏150mino1.3.2心肌梗死面积测俺

7、除假手术组外每组各取大鼠5只，再灌注完成后重新结扎先前部位，用2%的伊文思蓝2mL经腹腔静脉注入，使心脏染色以区分非缺血区（蓝染区）和缺血区（非蓝染区），迅速取下心脏，剪去心房和右室后无菌纱布吸干表面水分，放入-209冷藏，沿长轴成1mm〜2mm的薄片5张，将切片浸入1%TTC的磷酸缓冲液中（pH值7.4）379孵育30min,再用10%的甲醛固定24h以增强染色颜色对比，照相。心肌组织分为妙正常心肌，浅红色为缺血未梗死心肌，灰白色为梗死心肌。通过计算机图像分析软件计算梗死心肌占左寵齡匕(IR/LV)。

8、1.3.3Westernblot法测定p-CREB蛋白表达提取心肌组织匀浆液，用BCA法检测蛋白定量，进行蛋白制样，mSDS-PAGE凝胶，然后提取上样量40g/lane,采用BI0-RAD电泳统80V45min浓缩100V80min进行电泳分离转膜200mA2h、5%脱脂奶粉封闭，加入cAMP反应元件结合蛋白一抗，稀释浓度为1：10000,加入二抗进行蚕2h,化学发光显色，按相对比值进行相对定量，即各蛋白目的条带光密度相对强度二各蛋白目的条带灰度值/假手