孕妇外周血中胎儿细胞的分离、纯化及在无创性产前诊断中的应用

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1、孕妇外周血中胎儿细胞的分离、纯化及在无创性产前诊断中的应中华妇产科杂志1998年第8期第0卷综述作者：戚庆炜孙念怙单位：100730中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科目前，获取胎儿细胞进行产前诊断的方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛采取和脐静脉穿刺。这些手段对于胎儿有一定的风险性,有导致流产发生的可能。而从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞用于产前诊断，则属无创性手段，不仅取材方便，易于为孕妇所接受，且风险小，不会对胎儿造成任何不良影响，亦不受孕妇年龄、病史等的影响。近年来，随着单克隆抗体技术、流式细胞计数技术以及聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(F

2、ISH)技术的发展，已使从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞成为可能，并在无创性产前诊断方面得到一定程度的临床应用。但目前对这一问题还存在不少争论，我们复习了有关文献，对这方面的进展综述如下。一、孕妇外周血中胎儿细胞的分离与纯化孕妇外周血中胎儿细胞的数目极少，Price等［1］估计胎儿有核红细胞与孕妇外周血中有核细胞的数目之比约为1：(IX107〜IX108)左右。要进行无创性产前诊断，须首先将胎儿细胞从孕妇外周血中分离纯化出来。目前分离胎儿细胞的方法主要有以下3种：荧光激活的细胞分选法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS

3、)又称流式细胞计数法(flowcytometry):利用免疫磁性珠的分离方法(immunomagneticbeads)和磁场激活的细胞分选法(magneticactivatedcellsorting,MACS)□Bianchi等［2］对这3种方法进行比较之后认为，FACS为最佳的分离方法。20ml母血中可获得10〜15个胎儿整倍体细胞，这已能满足产前诊断的需要，而非整倍体胎儿细胞的数冃则远高于此，Simpson等［3］分析这可能是由于怀非整倍体胎儿的孕妇胎盘，允许更多的胎儿非整倍体细胞渗透到母血循环中去的缘故。这对于产前遗传学诊断是十分有利的。究竟在妊娠的哪

4、一阶段是抽取孕妇外周血分离胎儿细胞进行产前诊断的最佳时机，这一问题至今尚未明确。人们总是希望能及早做出产前诊断。Thomas等［4］报道，利用PCR技术在孕33天和40天即可以从怀男性胎儿的孕妇外周血中测到Y特异性DNA；Ganshirt等［5］利用三重密度梯度离心法和MACS,在孕5周的孕妇外周血中分离出足够量的胎儿有核红细胞，提示早在孕5周即可做出产前诊断。二、孕妇外周血中胎儿细胞的类型及其在产前诊断中的应用价值通过胎盘屏障进入母血循环屮的胎儿细胞有3种：有核红细胞、滋养细胞和淋巴细胞。从孕妇外周血屮分离纯化胎儿细胞的一个关键问题是需要在胎儿细胞表面找到

5、能与母血细胞相区别的特异性标记抗原，以制备出特异的单克隆抗体。以下就存在于孕妇外周血中的3种胎儿细胞的具体分离方法及其在产前诊断中的应用价值做一简要评述。1.滋养细胞：滋养细胞在早孕期的孕妇外周血中数目较多，但它们很快就隐藏于肺内而在外周血中数目极少［6］。Covone等［7］于1988年报道，用合体细胞抗原（H315抗原）的单抗从孕妇外周血中分离出了滋养细胞，但他们发现所分离的11315抗原阳性细胞中混有相当数量的母血细胞。他们解释这可能是由于胎儿胎盘组织碎片进入母血循环中而被母血细胞吸收，或H315抗原脱落游离于母血循环中而被母血细胞吸收，使少量母血细胞

6、出现H315抗原阳性，从而使滋养细胞特异的H315抗原变成了非特异性抗原，大大降低了诊断的准确率。以后一些学者继续探索用不同的方法和不同的细胞表面标记物分离滋养细胞，Muller等［8］经过6000多次试验，筛选出5种抗滋养细胞的单抗，用其中的2种与免疫磁性珠相结合，已成功地从母血中分离出了滋养细胞；Sbracia等［9］用抗HLA-G单抗、Durrent等［10］用抗肿瘤抗体分离滋养细胞亦获得成功，但缺少特异性单抗这一关键问题仍未能得到彻底解决。而且，若用FISH技术对滋养细胞进行产前遗传学诊断，则必须分离出单核滋养细胞，这也是一个棘手的问题；同时，也不能

7、排除滋养细胞存在嵌合体的可能性。由于以上种种原因，滋养细胞用于产前诊断的价值目前尚难以评价。1.淋巴细胞：1979年Herzenberg等［11］报道利用抗HLA-A2抗原的单抗及FACS技术，从孕妇外周血中分离岀胎儿淋巴细胞,以后也有不少利用胎儿淋巴细胞进行产前诊断的报道［12］,但在这方面却存在一些实际问题难以解决。首先，由于在早孕期胎儿淋巴细胞尚未大量生成，故进入母血循环中的胎儿淋巴细胞的数目极少，因此，限制了其临床应用；其次，既往妊娠的胎儿淋巴细胞可在母血循环中长期存在，甚至可长达27年之久［13］,这大大影响了诊断的准确率。由于上述两个原因，胎儿淋

8、巴细胞难以用于产前诊断。2.胎儿有核红细胞（nucl