多聚酶链式反应(PCR)

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1、多聚酶链式反应扩增DNA片段教材内容:基础知识(一)PCR原理(二)PCR的反应过程实验操作操作提示结果分析与评价课题延伸练习一、课题目标本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用教材分析二、课题重点与难点课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点：PCR的原理。教材分析三、课题背景分析课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古

2、生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。教材分析四、基础知识分析与教学建议（一）PCR原理知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.TaqDNA聚合酶的应用。教材分析（一）PCR原理教学建议：理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条

3、件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2《遗传与进化》中的有关DNA复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，能够区分DNA的3′端和5′端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。教学建议（一）PCR原理教学建议：TaqDNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程，帮助学生加深

4、理解。教学建议（二）PCR的反应过程知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。教材分析（二）PCR的反应过程教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤──变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。教学建议(一)PCR原理体内DNA复制:模板DNA原料:d

5、NTP酶:解旋酶、DNApol.…起始引物、合成方向合成环境…解链→模板变性引物-起始→引物-模板复性子链延伸→子链延伸(一)PCR原理加样器的使用结果分析与评价此为紫外光吸收检测的结果检验法，实践中很少用；普遍采用琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果Fig.7.23DenatureAnnealPCRPrimersExtendPCRPrimersw/TaqRepeat…多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的了解PCR的基本原理，学习PCR的基本操作技术。二、实验原理多聚酶链式反应（Polymeras

6、eChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数

7、主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106。PCR的基本原理变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物PCR三步曲变性90～97℃退火45～65℃延伸72℃左右PCR过程(二)PCR的反应过程变性-复性-延伸多重循环(n)模板以2En扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间PCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和

8、传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面，也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系统学研究等其他领域。三、实验材料、器材及试剂待扩增的模板DNA；DNA热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，1.5ml离心管架，移液器，1.5ml离心管，0.2ml离心管，枪头等。dNTPs，Taq酶，引物一对，10×PCRReactionBuffer，TdH2OPCR反应体系的五要素：引物、酶、dNTP、模