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《SHP1表达及慢性粒细胞白血病进展初步探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、SHP1表达及慢性粒细胞白血病进展初步探【摘要】目的：探讨SHP1表达与CML急变的关系；构建SHP1真核表达载体.方法：应用RTPCR比较慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平;SHP1真核表达载体pcDNA3.0SHP1的测序，检测其mRNA和蛋白表达.结果：急变期患者SHP1转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异；pcDNA3.0SHP1转染K562细胞,可表达SHP1mRNA和蛋白.结论：SHP1的表达下调可能与CML由慢性期朝加速/急变期演化过程有关;成功构建了SHP1真核表
2、达载体pcDNA3.0SHP1.【关键词】白血病髓样进展期SHP10引言慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukaemia,CML)是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，近90%的患者肿瘤细胞中可以检测到BcrAbl融合基因，该基因催化自身和一系列底物的酪氨酸残基(tyrosineresidue,Tyr)发生过度磷酸化，导致多个信号传导通路的异常激活，最终导致CML的发生.SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP）家族的重要成员，能够通过催化受体Tyr残
3、基“去磷酸化”抑制信号传导.我们应用RTPCR比较了慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平，并克隆SHP1全长cDNA序列，构建真核表达载体，以用于进一步研究SHP1在CML发病及进展中的潜在作用.1对象和方法1.1对象CML患者11（男6,女5）例，中位年龄28岁.患者骨髓单个核细胞经按G显带制备染色体及核型分析和/或间期荧光原位杂交检测发现有Ph染色体和或/BcrAbl融合基因（表1）,临床诊断慢性期7例，急性期4例.正常对照选择骨髓未受浸润的恶性淋巴瘤患者3例.均抽取无菌肝素抗凝骨髓3〜
4、5mL,Ficoll分离单个核细胞，预冷PBS（pH=7.4）洗涤细胞2遍备用.HEL细胞和K562细胞购自上海细胞生物研究所；RPMI1640培养基为Gibco产品；胎牛血清为杭州四季青产品；MMLV逆转录酶和Taq酶为Promegar产品；总RNA提取试剂和Oligo（dt）15购自上海博彩公司；抗SHP1多克隆抗体购自BDTransductionLaboratories公司；RIPA细胞裂解液和低分子量蛋白Marker购自上海申博生物公司；人红白血病细胞HEL和CML急变K562细胞在含100mL/L胎牛血清的
5、PRMI1640培养液中，于37°C,50mL/LC02,饱和湿度的培养箱中培养，每24〜36h传代1次，取对数生长期细胞进行实验•表111名CML患者的临床资料序1.2方法1.2.1CML患者SHP1mRNA的表达SHP1上游引物：5’ACATTCTCCCCTTTGACC3’,下游引物：5’CTCAGGTACTGGTAATGCC3’，扩增产物414bp[1].细胞中甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA的水平也被检测作为内对照,GAPDH上游引物：5’AATCCCATCACCATCTTCCA3’,下游引物:5’C
6、CTGCTTCACCACCTTCTTG37,扩增产物590bp.实验组和对照组细胞同时各取5X106,Trizol提取总RNA.反转录体系25uL,包括RNA2ng,引物Oligo(dt)150.5ug,RNasin500nkat,4种dNTP浓度各为500umol/L,MMLV逆转录酶3334nkat,42°C反转录1h,95°C5min结束反应.PCR反应体系为20nL,包括反转录产物2uL,寡核昔酸引物各20pmol,4种dNTP浓度各为200umol/L,Taq酶6.7nkat.扩增条件：94°C45s,54
7、°C45s,72°C60s,循环29次，72°C10min结束反应.扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行吸光度分析，视频打印结果.1.2.2RTPCR克隆SHP1基因全长cDNA序列上游引物：5’ATAAGCTTHindlllGATGGTGAGGTGGTTTC3’；下游引物:5’GCCACCTGAGGACAGCTTAAGEcoRIAT3’.在上游引物5’末端引入Hindlll酶切位点，在下游引物3’末端引入EcoRI酶切位点.取1X107个HEL细胞，Trizol提取总RNA.PCR
8、反应体系为25uL,包括反转录产物3uL,寡核昔酸引物各20pmol,4种dNTP浓度各为200umol/L,Taq酶6.7nkat.扩增条件：95°C45s,65°C45s,72°C60s,循环32次，72°C10min结束反应.取PCR产物10uL,于10g/L琼脂糖电泳，70V恒压电泳60min后于凝胶图像光密度分析仪下观察并记录图像，视
