shp1表达与慢性粒细胞白血病进展的初步研究

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1、SHP1表达与慢性粒细胞白血病进展的初步研究【摘要】目的：探讨SHP1表达与CML急变的关系；构建SHP1真核表达载体.方法：应用RT?PCR比较慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平；SHP1真核表达载体pcDNA3.0?SHP1的测序，检测其mRNA和蛋白表达.结果：急变期患者SHP1转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异；pcDNA3.0?SHP1转染K562细胞，可表达SHP1mRNA和蛋白.结论：SHP1的表达下调可能与CML由慢性期朝加速/急变期演化过程有关；成功构建了SHP1真核表达载体pcDNA3.0?SHP1.

2、【关键词】白血病髓样进展期SHP10引言慢性髓系白血病（chronicmyeloidleukaemia,CML）是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，近90％的患者肿瘤细胞中可以检测到Bcr?Abl融合基因，该基因催化自身和一系列底物的酪氨酸残基（tyrosineresidue，Tyr）发生过度磷酸化，导致多个信号传导通路的异常激活，最终导致CML的发生.SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase，PTP）家族的重要成员，能够通过催化受体Tyr残基“去磷酸化”抑制信号传导.我们应用RT?PCR比较了慢性期和急变期CML

3、患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平，并克隆SHP1全长cDNA序列，构建真核表达载体，以用于进一步研究SHP1在CML发病及进展中的潜在作用.1对象和方法1.1对象CML患者11（男6，女5）例，中位年龄28岁.患者骨髓单个核细胞经按G显带制备染色体及核型分析和/或间期荧光原位杂交检测发现有Ph染色体和或/Bcr?Abl融合基因（表1），临床诊断慢性期7例，急性期4例.正常对照选择骨髓未受浸润的恶性淋巴瘤患者3例.均抽取无菌肝素抗凝骨髓3～5mL，Ficoll分离单个核细胞，预冷PBS（pH=7.4）洗涤细胞2遍备用.HEL细胞和K562细胞购自上海细

4、胞生物研究所；RPMI1640培养基为Gibco产品；胎牛血清为杭州四季青产品；M?MLV逆转录酶和Taq酶为Promegar产品；总RNA提取试剂和Oligo(dt)15购自上海博彩公司；抗SHP1多克隆抗体购自BDTransductionLaboratories公司；RIPA细胞裂解液和低分子量蛋白Marker购自上海申博生物公司；人红白血病细胞HEL和CML急变K562细胞在含100mL/L胎牛血清的PRMI1640培养液中，于37℃，50mL/LCO2，饱和湿度的培养箱中培养,每24～36h传代1次,取对数生长期细胞进行实验.表111名CML患者的临床

5、资料序1.2方法1.2.1CML患者SHP1mRNA的表达SHP1上游引物：5′ACATTCTCCCCTTTGACC3′，下游引物：5′CTCAGGTACTGGTAATGCC3′，扩增产物414bp［1］.细胞中甘油醛3?磷酸脱氢酶（GAPDH）cDNA的水平也被检测作为内对照，GAPDH上游引物：5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′，下游引物：5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′，扩增产物590bp.实验组和对照组细胞同时各取5×106，Trizol提取总RNA.反转录体系25μL，包括RNA2μg，引物Oligo(dt)150.5μ

6、g，RNasin500nkat，4种dNTP浓度各为500μmol/L，M?MLV逆转录酶3334nkat，42℃反转录1h，95℃5min结束反应.PCR反应体系为20μL，包括反转录产物2μL，寡核苷酸引物各20pmol，4种dNTP浓度各为200μmol/L，Taq酶6.7nkat.扩增条件：94℃45s，54℃45s，72℃60s，循环29次，72℃10min结束反应.扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行吸光度分析，视频打印结果.1.2.2RT?PCR克隆SHP1基因全长cDNA序列上游引物：5′ATAAGCTTHin

7、dⅢGATGGTGAGGTGGTTTC3′；下游引物：5′GCCACCTGAGGACAGCTTAAGEcoRIAT3′.在上游引物5′末端引入HindⅢ酶切位点,在下游引物3′末端引入EcoRI酶切位点.取1×107个HEL细胞，Trizol提取总RNA.PCR反应体系为25μL，包括反转录产物3μL，寡核苷酸引物各20pmol，4种dNTP浓度各为200μmol/L，Taq酶6.7nkat.扩增条件：95℃45s，65℃45s，72℃60s，循环32次，72℃10min结束反应.取PCR产物10μL，于10g/L琼脂糖电泳，70V恒压电泳60min后于凝胶图

8、像光密度分析仪下观察并记录图像，视频打