核酸适配体在白血病诊断中的应用

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1、核酸适配体在白血病诊断中的应用【摘要】白血病是由于造血干细胞恶性增生的克隆性疾病，临床诊断主要依据MICM综合性诊断的方法。现今，白血病早期的诊断还有待研究。指数富集的配体系统进化技术是一种新型体外筛选适配体的技术。因为适配体的特异性与制备后贮存及再使用的方便与经济等特点，在白血病的临床早期诊断、精准诊断提供了可能。【关键词】白血病；适配体；SELEX技术近几年来，应用细胞为靶标的指数富集配体的系统进化(cellbasedsystematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,Cel

2、l-SELEX)技术在肿瘤研究领域中已成为热点［1］。1990年，Tuerk报道了制备特异性寡核昔酸分子的技术，即SELEX技术。这是一种能与靶细胞高特异性、高亲和力结合的寡核昔酸技术,所制备的寡核昔酸分子被称为适配体(aptamer)。适配体可以是DNA或RNA,是在随机的寡核昔酸文库中，经过多次循环筛选、富集获得，它们的特点是能形成特定的三维立体结构，通过空间构型互补而与靶细胞高亲和性、高特异性结合。白血病是-•类造血干细胞恶性克隆性增生性疾病，异常行为表现在细胞生物学方面，主要休现为造血干细胞分化障碍、增殖过剩和凋亡障碍，发

3、生全身性组织细胞破坏。临床表现常为贫血、发热和出血以及肝、脾、淋巴结异常肿大等病状。近年来，分子生物学技术发展突飞猛进，分了诊断技术已应用于口血病的临床诊断，成为医学各学科发展的突破点，但是对白血病的精确诊断还存在一定的局限性。SELEX技术是一种新近研发的体外筛选技术，冃前，该技术已经成功在体外筛选出急性髓系白血病、急性早幼粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病细胞特异的适配体。这种方法在白血病分了诊断领研究域中引起了研究热潮。1、SELEX技术的优点与应用SELEX技术筛选在实际中的应用有以下优点：①库容量大、

4、特异性高、亲和性高，可以区分结构相近的物质；②靶细胞范围广，较大的蛋口质分子如酶、生长因子或小分子物质如金属离了、有机染料等都可以做为核酸适配体的靶分子［3］；③易体外筛选，可人工合成，准确性强、重复性好，大大减少了制备过程中的的批间误差；④易与-些特殊标记分子或治疗药物等和结合，便于标记与检测；⑤可修饰性。适配体做为单链的寡聚核昔酸片段，在进行精准的位点修饰后,还可以保持原有的生物学活性。可以对其进行荧光染料、生物素、放射性同位素标记，进行特异的位点修饰以提供精准的报告分子和效应分子，对肿瘤的特异诊断提供可能;⑥具有分子量较小,

5、稳定性能好，对温度不敏感，容易保存。肿瘤细胞与正常细胞在形态结构上有许多相似之处，所以可以应用SELEX技术以正常细胞为靶细胞筛选出特异性肿瘤标志物的适配体，可以应用于临床诊断与治疗，Hikce等以神经胶质母细胞瘤系U251为靶细胞，筛选出特异性U251细胞的适配体TTA1,通过特定二维闪烁成像技术就能获得清晰的肿瘤图像，从而应用于临床诊断。这些都是以止常细胞为靶细胞筛选而得的适配体，获得的适配体可以特异-结合到相应的肿瘤细胞上，从而为临床上获得新的肿瘤标志物提供了可能。2、适配体技术在白血病诊断中的应用SELEX技术是利用分子生

6、物学技术，在体外随机构建--个长度为20~60bp左右的单链寡核昔酸文库，将获得的单链寡核昔酸文库与靶分子结合，在特定的温度和环境下孵育,形成靶分子-核酸复合物，用缓冲液洗掉未与靶分了结合的寡核昔酸，用高温方法分离与靶分子结合的寡核昔酸，再用PCR以其为模板进行扩增，以扩增的次级文库为目标继续进行下一轮的筛选。SELEX技术不仅可以获得与靶细胞相结合的特异性适配体，还能够使该适配体可以辨别靶细胞所处的某种特定状态，所以该技术在白血病的早期诊断、分型诊断以及白血病新的特异标志物发现方面具有极大潜能。(1)适配体与急性早幼粒细胞白血病

7、(APL)诊断用急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株为靶细胞，采用K562细胞为阴性筛选细胞，应用指数富集配体的系统进化技术，从ssDNA文库中筛选出高特异的、高亲和力的适配体，采用分子克隆技术将筛选获得的适配体进行测序，发现3中特异克隆适配体序列CX9、CX5和CX1,进行质粒提取、PCR纯化、磁珠分离成功获取单个适配体序列，应用流式细胞技术对3种序列进行结合率测定。在荧光显微镜下观察荧光强度，最终证明CX9序列的亲和力较高。用Cell-SELEX技术成功筛选到急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株的特异适配体，为快速诊断和鉴定急性早

8、幼粒细胞白血病提供可靠地实验依据。(1)适配休与白血病淋巴细胞CCRF-CEM诊断适配体用可以于癌细胞的检测，利用DNA适配以及DNA酶的特性,对人类检测深入开展了研究，并且提出了一套新的检测方法。该实验体系具有操作方便的特性，并且研究表明许多靶细