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1、复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒初步实验探究［摘要］目的观察复方叶下珠滴丸体外的抗乙肝病毒作用。方法将复方叶下珠滴丸试药稀释后，分别加入HepG2.2.15细胞培养液和HBsAg阳性人血清中，T37°C5%C02培养箱孵育后，收取上清液，采用ELISA法及荧光定量PCR法，分析药物对细胞培养上清液和人血清培养液中HBsAg.HBeAg及HBVDNA含量的影响。结果复方叶下珠滴丸体外对HBsAg.HBeAg和HBVDNA有不同程度的抑制作用，抑制效果最好浓度为120mg/mL,时间为72h。结论实验结果证明复方叶下珠滴丸具有明显的体外抗乙肝
2、病毒作用。［关键词］复方叶下珠滴丸；体外抗病毒；乙肝病毒［中图分类号］R512.6+2［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)02(b)-0015-02乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一，每年约有50万人死于由HBV感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病［1-2］,目前临床尚无治疗乙肝的特效药物。复方叶下珠滴丸是由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等十六味草药经科学提取工艺精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益气健脾，抗
3、乙肝病毒，改善肝功能、调节免疫机能等功效，能防治急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本实验采用酶联免疫吸附检测（ELISA）技术和荧光定量（PCR）方法，分析复方叶下珠滴丸对HepG2.2.15细胞培养液及HBsAg阳性人血清培养液中HBsAg.HBeAg及HBVDNA含量的影响，观察复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的作用。1仪器与材料1.1试药与试剂试药：采用复方叶下珠滴丸处方中十六味草药以水提醇沉法（加水十倍，煎煮1h,醇沉浓度为60%）制成的流浸膏（每1niL含原生药材1g）为试药。试剂：HBsAg、HBeAg诊断试剂盒（新波
4、生物技术公司）,靶细胞选择HepG2.2.15细胞（HBV全基因传染的HepG2细胞）,HBVDNA荧光定量PCR试剂盒（上海复兴生物技术公司）。1.2仪器EFFICUTA2710免疫分析仪和全自动样本前处理系统，RocheLightCycler480lI实时荧光定量PCR系统，37°C5%C02培养箱（Phermo）o1.3统计学方法采用SPSSV19.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数土标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用x2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2方法与结果2.1细胞培
5、养将HepG2.2.15细胞按1X105/mL浓度加入2个24孔培养板中，放入3715%C02培养箱培养4d后换液，将试药稀释，分八组不同浓度药液各滴入4个孔，空白对照组以生理盐水滴入，亦4个孔，加药培养于72h后各收取1孔细胞上清液，用ELISA测定HBsAg.HBeAg和PCR检测其HBVDNA含量，并将每组数据与空白对照组进行配对T检验，结果见表1。根据以上实验，确定复方叶下珠滴丸试药最佳抑制效果浓度为120mg/mLo为考察其最佳抑制时间，再以120mg/mL浓度的复方叶下珠滴丸试药，按以上方法培养，加药培养后于24、48、7
6、2、96h后收取1孔细胞上清液再检测其HBsAg、HBeAg和HBV-DNA,48、72、96h组间数据分别与24h组进行统计学分析，结果见表2。2.2血清培养将复方叶下珠滴丸试药稀释为120mg/mL溶液分5组加入HBsAg阳性人血清(HBsAg为2.634ng/mL,HBeAg为4.799PEIU/mL,HBV-DNA为650300IU/mL),对照组则加入生理盐水，于37*孵育72h,取上清液分别用ELISA测定各组HBsAg.HBeAg和PCR测定各组HBV-DNA,并作统计学分析，结果见表3。3讨论复方叶下珠滴丸是以叶下珠为
7、主药经科学提取工艺精制而成的滴丸，叶下珠为大戟科植物，有清热利尿、平肝明目、消积解毒、止泻之功效，含软质类、黄酮类、香豆素类等多种活性成分[3],对肝损害具有保护作用，能预防原发性肝癌发生[4],具有抗肝纤维化、抗乙型肝炎病毒的作用[5],并对肝癌、胃癌多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6-7]o辅药中半边莲对肝癌也有明显的抑制作用[8],半枝莲则可提高机体的抗氧化能力，对肝损伤有保护作用[9],鸡骨草也有显著的抗乙肝病毒作用[10]。在HepG2.2.15细胞培养实验中，随着复方叶下珠滴丸试药浓度的增加，对乙肝病毒的抑制作用逐渐增强，
8、呈现一定的剂量依赖性，但其试液浓度为140mg/mL时对HBsAg.HBeAg抑制作用最强，而其对HBVDNA的抑制作用最强浓度则为120mg/mL；而其最佳抑制时间的培养试验中，72h组与96h组中的HBsAg.HBe
