b和c基因型重组乙型肝炎病毒构建及其相关的研究

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1、军医进修学院博士学位论文B和C基因型重组乙型肝炎病毒的构建及其相关研究中文摘要研究目的：1．构建B和C基因型重组乙型肝炎病毒及检测其在Huh7细胞内的复制和表达。2．探讨B和c基因型乙型肝炎病毒对Huh7细胞全基因组表达模式的影响是否相似。3．评价针对重组B矛[IC基因型HBVS区目的小发夹RNAs(shRNAs)在存在错配的情况下对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用，对HBsAgmRNA水平的抑制作用，及对HBVDNA复制的抑制程度。研究方法：1．根据相关文献设计扩增HBV全基因组的引物，分别从感染B和C基因型的患者血清中提取

2、HBVDNA作为模板，应用高保真热启动TaqDNA聚合酶扩增HBV全基因组；2．SacI酶切扩增的全长HBV和pUCl9，应用T4DNA连接酶使HBV插A．pUCl9_t2的SacI酶切位点，命名为pUCl9．BHBV$1pUCl9-CHBV；3．应用SapI酶切pUCl9一HBV矛[]pHYl06真核表达载体，将获得的全长HBV在与线性的pHYl06连接，使全长HBV插入pHYl06的SapI酶切位点，命名为pHY106一BHBV和pHY106一CHBV；4．将pHYl06一BHBV和pHYl06一CHBV分别转染Huh7细胞，

3、以pHYl06空载体转染作对照；①分别于转染后24h、48h和72h取细胞培养上清，．20℃冻存，用于ELISA检NI]HBsAg和HBeAg表达；②转染后72h，裂解细胞，提取细胞P勺HBV核心颗粒内HBV复制中间体，用于Southernblot检测；③转染后72h，用PBS洗细胞5次，裂解细胞，应用Real．timePCR定量检测Huh7细胞HBVDNA水平。5．基因芯片技术：B或C基因型重组乙型肝炎病毒(即pHYl06一BHBV，pHYl06．CHBV)转染Huh7细胞，以pHYl06空载体为对照，48h后提取细胞mRNA，

4、逆转录为cDNA，与芯片杂交，用GenePixPr03．0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度，计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio，Ratio--2军医进修学院博士学位论文Cy5／Cy3筛选出Ratio大于2或小于0．5的基因点，这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异；6．实时定量PCR．pHYl06一BHBV，pHYl06一CHBV转染Huh7细胞48h，以pHYl06空载体为对照，提取细胞总RNA，逆转录为eDNA，应用实时定量PCR对基因芯片差异表达的部分基因进行验证。7。将shRNAs分别

5、和B或C基因型重组HBV，H[JpHYl06．BHBV和pHYl06．CHBV共转染HepG2细胞；于转染后24h、48h、72h、96h和120h分别取细胞培养上清，．20℃冻存，留作ELISA检i贝lJHBsAg和HBeAg表达水平；8．shRNAs分别和B或C基因型重组HBV转染HepG2细胞72h后，应用Trizol法提总RNA，逆转录为cDNA，进行RT-PCR，对HBsAgmRNA水平进行半定量检测；于转染后72h，裂解细胞，提取HBV核心颗粒内的HBV复制中间体进,lTSouthemblot实验。结果：1．成功构建了

6、pHYl06一BHBV和pHYl06．CHBV两个表达载体；2．pHYl06一BHBV和pHYl06一CHBV转到Huh7细胞后，检测到了HBsAg和HBeAg的表达，HBsAg表达于48h达高峰，HBeAg的表达高峰晚于HBsAg约24h；3．应用Southernblot检测到了细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体，包括rcDNA，dsDNA和ssDNA；4．应用Real—timePCR定量检测发现转染到Huh7细胞内的pHYl06．BHBV和pHYl06．CHBVHBVDNA拷贝数高，于72h达高峰，可达8log10g5．

7、pHYl06．BHBV转染Huh7细胞48h后，从4097个基因中筛选出差异表达基因共60条，其中1条基因表达明显增强，59条基因表达降低明显；6．pHYl06．CHBV转染Huh7细胞48h后，筛选出差异表达基因共122条，其中34条基因表达明显增强，88条基因表达降低明显；7．实时定量PCR验证上述芯片结果，证实pHYl06一BHBV转染Huh7细胞48h后，IFNGR2、GPRl25、DDEF2和P13KmRNA表达水平均不同程度下调，相对表达率分别为0．8、0．5、0．3和0．4，与基因芯片结果基本一致；pHYl06．CH

8、BV转染Huh7细胞48h后，EEF2、1NF592表达下调，相对表达率分别为0．8和0．6，与基因芯片结果符合。军医进修学院博士学位论文8．shRNA·458和shRNA·635对B和C基因型HBVHBsAg和HBeAg表达具有很强抑制作用，转染