CHAPTER 12 酵母基因工程

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1、酵母基因工程YeastgenenicengineeringChapter12Chapter12酵母基因工程酵母：单细胞真核微生物繁殖方式：有性、无性生殖1996年，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)完成全基因组的测序。酵母细胞结构图第一节酵母基因工程的发展现状酵母是真核生物，安全性高；酵母繁殖速度快；采用高表达的启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控；作为真核生物，提供翻译后加工和分泌的环境，使产物与天然蛋白一样或类似。一、酵母表达系统的优点酵母菌可将表达的外源蛋白与N-末端前导肽融合，指导新生肽分泌，在

2、分泌的过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰；不会形成不容性的包涵体，易于分离纯化；可以移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使用中引起免疫反应的问题；酵母可进行蛋白的N-乙酰化、C-甲基化等，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要作用。一、酵母表达系统的优点现有：酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、烷烃利用型解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。主要应用于：改造酵母本身提高发酵性能利用酵母作为宿主表达异源蛋白二、酵母基因工程的发展现状(1)将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，而占麦芽汁总糖25％的多糖和

3、糊精不能被利用，导致啤酒的高热量。将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和糊精。1.酿酒酵母的自身改造(2)将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母麦芽汁中残留的大分子蛋白质很容易影响啤酒的胶体稳定性，而酿酒酵母的胞外蛋白质酶活力很弱，很难水解蛋白质。将外源的蛋白质水解酶导入酿酒酵母基因组中，利用自身分泌蛋白质水解酶可以降解一些大分子蛋白质。1.酿酒酵母的自身改造(3)将β-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母大麦的β-葡聚糖酶不耐热，在发芽和糖化过程中极易被破坏，同时啤酒中残留的β-葡聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物

4、、沉淀物和胶凝等问题。将β-葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效率。1.酿酒酵母的自身改造(4)将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达，可以促进SO2的生成，可以维持啤酒风味的稳定。(5)将人血清清蛋白HAS基因转化到酿酒酵母，可以生产富含HAS的啤酒新品种。1.酿酒酵母的自身改造表达水平：大多达到1g/L，高达10g/L。高效表达的实现：开发高效启动子提高和控制外源基因的转录水平(AOX1)；提高表达载体在细胞中的稳定性；通过多次同源重组以及rDNA介导的整合方式提高表达基因在细

5、胞中的拷贝数。2.酵母表达系统表达异源蛋白表达质量：异源蛋白由于过糖基化导致潜在免疫性而不能医用，必须使表达的产物结构与天然产物一致。提高表达质量：提高遗传稳定性，选用不同的酵母宿主2.酵母表达系统表达异源蛋白1.解决酵母基因工程中存在的缺陷外源蛋白形成聚合体、信号肽加工不完全以及内部降解造成表达产物结构上有差异2.应用于人类基因组计划3.利用酵母基因工程筛选更多的新药4.改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本5.生理承受极限引起关注三.酵母基因工程的发展趋势第二节酵母表达系统1.酵母表达载体(1)基本构架：穿梭质粒，原核部分:ori

6、和抗生素抗性基因；酵母部分:在酵母中维持复制的元件：如染色体自主复制序列ARS或整合型载体的整合介导区；酵母转化子筛选组分：主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列或抗生素抗性基因；编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。一、酵母表达系统概述(2)载体的复制形式附加型载体特点：拷贝数量大，传代中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。代表：2μm质粒和利用ARS的载体整合型载体特点：与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但拷贝数低。必须在酵母细胞内找到拷贝数很高的靶位点，位于第七号染色体上的rDNA单元，是100－200个拷贝的串联重复

7、序列。1.酵母表达载体pPIC9k质粒图谱AOX--醇氧化酶S---分泌信号MCS–多克隆位点TT---终止信号HIS4--组氨醇脱氢酶Kanamycin---抗卡拉霉素基因pBR322---大肠杆菌的复制起始位点Ampicillin---抗氨苄青霉素基因安全无毒，不致病遗传背景清楚，容易进行遗传操作构建的载体DNA容易进入，转化效率较高发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度发酵蛋白质分泌能力良好有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能2.宿主原生质体法离子溶液法(Cs+、Li+)PEG1000法电穿孔法和粒子轰击法3.酵母的D

8、NA转化方法酿酒酵母：过度糖基化(＞40个甘露糖残基)巴斯德毕赤酵母：8-14个甘露糖残基，分泌的糖蛋白的聚糖末端不含1,3-连接的甘露糖残基。解脂耶氏酵母：8-10个甘露糖残基4.酵母分泌外源蛋白的糖基化1.酿酒酵母表达系统附加型载