15 酵母基因工程

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1、第十五章酵母基因工程五、酵母菌的表达系统第十五章酵母基因工程三、酵母菌的载体系统二、酵母菌的宿主系统一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征六、利用重组酵母生产乙肝疫苗四、酵母菌的转化系统一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征第十五章酵母基因工程1、酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。一、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征2、

2、酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第十五章酵母基因工程二、酵母菌的宿主系统2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌第十五章酵母基因工程1、广泛

3、用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突

4、变类型ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-提高重组蛋白表达转录水平突变类型生物效应作用位点3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌能抑制超糖基化的突变类型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型突变类型生物效应许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源

5、蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌（1）泛素、介导的蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aaubiquitinligaseE3LysubiquitinligaseE3Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关

6、闭UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能UBI4缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效三、酵母菌的

7、载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒第十五章酵母基因工程酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2m环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同pGKL18.9kbD