第七章、酵母基因工程

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1、酵母基因工程A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征B酵母菌的宿主系统C酵母菌的载体系统D酵母菌的转化系统E酵母菌的表达系统F利用重组酵母生产乙肝疫苗A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。A酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便

2、具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物B酵母菌的宿主系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克

3、鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型突变类型生物效应作用位点ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1

4、提高重组蛋白表达转录水平ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-提高重组蛋白表达转录水平抑制超糖基化作用的突变宿主菌许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。能抑制超糖基化的突变类型酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生突变类型生物效应型酿酒酵母对异源蛋白的mnn甘露糖生物合成缺陷型糖基化反应很难控制，呈alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型超糖基化倾向，因此超糖och外侧糖链添加缺陷型基化缺陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用靶蛋白LysHOOCUbi

5、quitin76aaUbiquitin76aaubiquitinligaseE3靶蛋白LysubiquitinligaseE3靶蛋白Lys蛋白酶体在真核生物中，蛋白酶体位于细胞核和细胞质中。主要作用是2004年诺贝尔化学奖的获奖主题就是蛋白质酶降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。解在细胞中的重要性和泛素在酶解途径的作用减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭UBI3编码

6、泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ub

7、c4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效C酵母菌的载体系统酵母菌中的野生型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的2μ环状质粒REP1FLP几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双链IR环状质粒，拷贝数达50至100个。RAFAIRs反向重复序列，600bp，重组oriIRFLP编产物动编码产物驱动IRs的重的同源重组STBREP2REP编码产物控制质粒的稳定性同源重组STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质B粒类