分离分析化学4-2色层分析法

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1、四.凝胶层析（Gelchromatography）1凝胶层析（gelchromatography）也称：分子筛层析分子排阻层析凝胶过滤凝胶色谱等混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。简介凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。44.1凝胶层析的基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA，它

2、包括填料的骨架体积VGM，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。VA=Vi+V0+VGM1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。（Vo）2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi）3、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（VGM）4、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（VA）5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（Ve）则：Vt=Vo+Vi+Vg流动相体积固定相体积总体积78原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停

3、留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+ViKd1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠11（一）平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到

4、平衡。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。12（二）扩散分离理论溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1．流速为0.65ml/min；2．流速为2.0ml/min溶剂为甲苯13（三）流动分离理论红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。流动分离理论是凝胶色谱分离机理的一种理论模型。它把凝胶填料内的孔隙设想成由许多平行的毛细管组成。毛细管的排除效应使体积大的分子不能进入管内，而在管外，流动相流速大于管内。在能进入管内的溶质分子中

5、，较大的溶质分子被流速场集中到管子中心而加快移动，较小的溶质分子因处于管内壁附近而降低了移动速度。其结果是溶质按分子体积大小分离。15分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。16分离过程最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻”或“部分

6、渗入”。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi17分配系数Kd排阻系数：当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。18物质的Kd值19凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。204.2凝胶的结构和性质一、葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）

7、四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）21一、葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为SephadexG类。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。交联葡聚糖凝胶的化学结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，