色层分离法生物分离工程.ppt

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1、色层技术（层析技术）色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。色层分离方法－Chromatography色层分离法是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必须包括两个相。一相是固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次

2、差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。层析法的发展过程1903年Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。1931年色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技术。1938年Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法。1938年Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同位素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱才得

3、到广泛应用。1944年在美国橡树岭国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学完成了超铀元素的分离。1941年Martin和Synge发展了分配色谱。1944年Martin等发展了纸色谱。1952年Martin和James发展了气-液分配色谱。1956年VanDeemter等发表关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色谱中。1957年制作离子交换色谱氨基酸分析仪。1959年在CordonConference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告。1963年Gidd

4、ings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。60年代中期凝胶渗透色谱出现。60年代后期亲和色谱出现。1969年现代液相色谱开始受到重视。有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：1948年瑞典科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖，1952年英国的Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。层析的原理“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”——马丁（A.J.P.Martin）（英）层析分离法常用的

5、层析技术有(亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳）特点：（1）纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）最终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品层析分离分类（1）按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）凝胶过滤（分子大小与形状）实验技术分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动）⑴分析色谱（10mg）⑵半制备色谱(10-50mg)⑶制备色谱(0.1-1g)⑷工业生产规模色谱(

6、>20g/d)年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激因子（rhGcs-F），其产值高达1亿元。层析分离分类（3）层析分离分类（3）根据固定相形状分类柱层析纸层析薄层层析根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析按操作方式分类（展开）迎头法（frontalanalysis)顶替法（displacementanalysis)洗脱分析（elutionanalysis)基本概念（1）分配系数溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值（3）分离因素某一瞬

7、间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值(5)洗脱（容积）溶出体积在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6)分辨率两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比(7)理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（8）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>分配系数在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律：Kd=C1/

8、C2Kd为分配系数C1，C2为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定低浓度解离常数和分离因数）mt-结合溶质分子的有效位子总浓度m-空余的有效结合位子浓度q-溶质在固相的浓度c-溶质在液相的浓度解离常数图3恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象Rf=阻滞因数Am—流动相的平均截面积As---固定相的平均截面积流动相的移动距离＝V/Am洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积理论塔板fr—第r块塔板上溶质