高分辨熔解曲线分析技术在地中海贫血基因诊断及产前诊断中的应用分析-妇产科学专业毕业论文

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1、第一篇高分辨熔解曲线分析技术检测a地中海贫血常见三种点突变研究生：魏明导师：廖灿教授专业：妇产科学中文摘要a地屮海贫血（a-thalassemia,简称a地贫）是由于a珠蛋口基因缺失（缺失型）或点突变（非缺失型）导致a珠蛋口肽链合成减少或缺失而引起的一种溶血性贫血,呈常染色体隐性遗传。我国最常见的3种缺失型突变为…SEA、・a3・7和・疋.2,最常见的3种非缺失型突变为HbConstantSpring（HbCS）＞HbQuongSze（HbQS）和HbWestmead（HbWS）O血红蛋ABarfs水肿胎无法存活，临床

2、上出生后最为严重的a地贫类型是血红蛋白H病（HbH病）。HbH病可分为缺失型HbH病和非缺失型HbH病，而非缺失型HbH病的临床症状往往重于缺失型HbH病。因此在产前诊断中需特别注意避免漏诊非缺失型HbH病。目前血红蛋白毛细管电泳技术能够筛查HbCS,但无法筛查HbQS和HbWSo对于单纯的a地贫点突变携带者，临床上多无症状，且血常规及血红蛋白分析多无异常，因此在地贫筛查时很容易漏诊（除外HbCS）0在产前筛查时，若夫妇一方为J地贫，则另一方就有必要进行点突变检测。目前用于检测非缺失型a地贫的方法主要有反向斑点杂交、等

3、位基因特异性PCR及测序等,但这些方法均存在一定局限性。木研究将高分辨熔解曲线分析技术（highresolutionmelting,HRM）用于检测中国人群常见3种a地贫点突变，并探讨其临床应用价值。一、目的应用高分辨熔解曲线分析技术检测屮国人群常见3种a地贫点突变:HbConstantSpring(HbCS)>HbQuongSze(HbQS)和HbWestmead(HbWS),以建立一种简便快捷、成本低廉、准确可靠、高通量的分子筛查方法。二、方法1.样本采集：收集2008年12刀至2011年10刀基因型已知的a地贫点

4、突变携带者样本81例，均经跨越断裂点聚合酶链反应(gap-polymerasechainreaction,gap-PCR)>反向点杂交(reversedotblot,RDB)和DNA测序检测。其中男性34例，女性44例，年龄范围为4天・50岁，另外还包括3例产前诊断样本(羊水、绒毛、脐血各1例)。另收集2011年6月至2011年9刀的正常健康人样本14例，其中男性5例，女性9例，年龄范围为22岁・48岁。正常对照样本经测序验证不含a((Xi和(X2)珠蛋白基因点突变。所有样本均来自广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心。2

5、.PCR扩增：采用LightScannerPrimerDesign软件(美国IdahoTechnology公司)设计1对引物同时扩增w和(X2珠蛋白基因第3外显子，扩增区域覆盖HbCS、HbQS和HbWS点突变。建立并优化PCR反应体系。3.HRM分析：PCR扩增完成后采用LightScanner96(美国IdahoTechnology公司)进行HRM分析，应用LightScannerSoftwarewithCall-IT2.0软件分析结果。三、结果经HRM分析显示出5种类型的熔解曲线：(1)HbQS(aQSa/aa)

6、；(2)HbQS合并」EA或・『2(aQSa/__SEA(3)虽CS及HbCS合并缺失型突变(产讥似a%/_SEA、尸弘『2、acsa/-a3-7)；(4)HbWS及HbWS合并-SEAgK-a37(awsa/aa,严曲心；(5)健康对照组(aa/aa)0所有a地贫点突变样本均可与正常对照正确区分，且HbQS与HbQS合并缺失型突变可相互区分。采用HRM筛查HbCS、HbQS及HbWS的灵敏度和特异性为100%。四、结论HRM分析技术是一种简单、准确、快速、高通量、低成本的遗传学分析方法,可作为屮国人群常见三种a地贫点

7、突变筛查的优选方法。关键词：高分辨熔解曲线；a地中海贫血；点突变PartIHigh・resolutionmeltinganalysisofthethreecommonpointmutationsofalpha-thalassemiaAbstracta-thalassemiaisakindofhemolyticanemiainheritedinautosomalrecessivemode.Itresultsfromdeletionsorpointmutationsofalphaglobingenesleadingtore

8、ducedorabsentsynthesisofalphaglobinchain.ThethreemostcommondeletionalmutationsintheChinesepopulationare—and-a?andthethreemostcommonnon-deletionalmutationsareHbConsta