贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用

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1、贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用王彩霞吴绍强林祥梅王素华冯春燕徐康中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所浙江省温摘要：以焦磷酸测序技术为检测平台，在研究包纳米虫基因特性的基础上，选择包纳米虫(Bonamiaspp.)DNA序列的保守区域，利用焦磷酸测序软件设计专用引物。以0IE推荐的PCR方法构建的阳性质粒作为模板，建立了包纳米虫的PCR-焦磷酸测序检测方法，确定测得序列为包纳米虫序列，经酶切位点分析可鉴别感染种类。以建立的包纳米虫PCR-焦磷酸测序方法对进口牡蛎(Ostrcagigasthunberg)样品进行检测，同时以01E推荐的PCR-RFLP方法

2、进行对照检测，检测结果表明，木研究建立的PCR-焦磷酸测序检测方法可以在基因序列水平上准确鉴定样品是否为包纳米虫感染以及感染种类，检测结果与OTE推荐方法的检测结果一致。研究结果表明，本研究建立的检测方法可应用于口岸包纳米虫感染情况的检测鉴定。关键词：牡蛎;包纳米虫;聚合酶链式反应;焦磷酸测序;检测；鉴定;作者简介:王彩霞(1982-),女，助理研究员。E-mail:fridayl28@sina.com作者简介：吴绍强E-mail:sqwu@sina..com收稿日期:2016-12-11基金：国家科技支撑计划项目(2013BAD12B02)资助Developmen

3、tandApplicationofPyrosequencingMethodDetectingBonamiaspp.CausedDiseaseofBivalvesWANGCai-XiaWUShao-QiangLINXiang-MeiWANGSu-HuaFENGChun-YanXUGengTheInstituteofAnimalQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine;WenzhouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau;BureauofAnimalHusbandryan

4、dVeterinaryinYirmnCountyofShandongProvince;Abstract：OnepairofspecificprimersweredesignedandusedtopyroscqucncingtheconservedregionofBonamiaDNAwithPyroMarksoftwarebasingonpyrosequencingplatformandBonamiagenecharacteristics.PCR-pyrosequencingmethodwasestablishedwiththerecombinantplasmidof

5、Bonamiaspp.constructedwithOTEPCRmethodasthetemplate.TheobtainedsequeneecanbeidentifiedasthesequeneeofBonamiaspp.throughBlastanalysis,andenzymedigestionsiteanalysisidentifiedthespecieasBonamiaspp..TheimportedoystersweredetectedwiththenewlydevelopedmethodandPCR-RFLPaswellaswasrecommended

6、byOTE.TheresultshowedthatthedevelopedPCR-pyrosequencingmethodcanbeusedtocorrectlyidentifyingBonamiaspp.infectionandspecies.ThedetectionresultswereconsistcntwiththatyieldedwithOIEmethod.Therefore,thismethodcanbeappliedtothedetectionandidentificationofBonamiaspp.infectioninport.Keyword：O

7、yster;Bonamiaspp.;PCR;pyroscqucncing;dctcction;identifiedtion;Received：2016-12-11牡蛎包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)、杀蛎包纳米虫(B.exitiosa)等在牡蛎(Oyster)血细胞内寄牛或者游离在结缔组织、鲍、内脏或套膜上皮中而引起贝类的一种严重的寄生虫病。现发现的包纳米虫包括5个种，除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包纳米虫(B.ostrceic)、杀蛎包纳米虫(B.exitiosa)［1］外,述有寄生在悉尼牡蛎体内的鲁道夫包纳米虫(B.roughley