焦磷酸深度测序检测hiv-1劣势耐药株方法的建立及初步应用

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1、学校代码：学号：焦磷酸深度测序检测HIV一1劣势耐药株方法的建立及初步应用专业年级：北京协和医学院临床医学专业2005级姓名：丛杨导师：李太生教授北京协和医学院临床学院(北京协和医院)感染内科完成日期：2013年6月‘目录舅邺一3．焦磷酸深度测序结果的解读⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43附录我国“十一五”HIV／AIDS抗病毒治疗队列一说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．492缩略词加SADRAS-PCRbpcARTDNADPSHⅣNNRHsNRTIsRNARTRT-pCRSGS勰In叮AIDSUDPS眨缩略词表英文全称中文全称AcquiredImmuneDeficiencySyndrome获得性免疫缺陷综合症AcquiredDrugResistance获得性耐药Allele—SpecificPolymeraseChainReaction位点特异性聚合酶链式反应basepair碱基对CombinedAntiretroviralThe

3、rapy联合抗反转录病毒疗法DeoxyribonucleicAcid脱氧核糖核酸DeepPyrosequencing焦磷酸深度测序HumanImmunodeficiencyVirus人类免疫缺陷病毒Non．Nucleosidereverse-transcriptaseinhibitors非核苷类逆转录酶抑制剂Nucleosidereverse-transcriptaseinhibitors核苷类逆转录酶抑制剂ribonucleicacid．核糖核酸reversetmnscdptase逆转录酶reversetransc

4、riptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链反应SingleGenomeSequence单基因组测序transmitt甜drugresistance传播耐药性UnitedNationsPr0蹦衄eonHIV／AIDS联合国艾滋病规划署ultra-deeppyrosequencing焦磷酸超深度测序viralIDad病毒载量中文摘要【目的】：建立焦磷酸测序检测HlV-1耐药劣势株平台，利用该方法探究HIV耐药劣势株在中国HIV／AIDS初治且疗效不佳患者中的流行数据及所起到的作用。防．法l

5、：通过寡核苷酸标准品及人工合成序列对焦磷酸定量测序的线性、敏感性及稳定性进行测定。对HfV-l基因组RT区的若干针对NRTIs及NNRTIs的重要耐药突变位点设计包括PCR及焦磷酸测序引物，测序碱基分配顺序等测序方案。研究对象以我国“十一五”HⅣ-／A]DS抗病毒治疗队列一(即初治患者)为基础，选取其中病毒学治疗失败患者，取起始治疗前血浆及部分病毒载量反弹后的血浆提取HIV-RNA，采用RT-PCR的方法对RT区基因进行扩增，使用焦磷酸测序方法对若干重要耐药位点进行定量测序，比对患者在基线至病毒载量反弹的临床数据信息

6、(CIM+T淋巴细胞计数、HIV病毒载量、依从性及血药浓度、常规测序序列)，进而探讨焦磷酸测序进行劣势耐药株检测对于HIV／AIDS患者临床治疗决策的意义和价值。f结果】：1．通过标准品、人工合成K103N野生及突变型序列成功标定本实验测序精度及线性，检测敏感度最低可达1‰检测线性经线性回归，R2=o．9978。2．设计针对NNRTI类及NRTI类药物耐药的8个位点(包括针对NNRTI类的K103N、Y181ClV；针对NRTI类的M184VI、D67N、K70ER、L210W、T215YF、K219QE等)及相关的

7、PCR引物及测序引物和核菅酸分配序列。使用含B型和AE型HIV病毒的血浆测试焦磷酸测序方案及上述8个位点，均获成功。3．对我国“十一五"HIV／AIDS抗病毒治疗队列一(即初治患者)患者的所有患者基线血浆标本进行常规耐药检测，选择常规方法未检出耐药，但出现病毒学失败的患者40例，对其基线血浆标本进行上述8个位点的焦磷酸测序。共检测出劣势耐药突变19个，以K103N，Y181C出现频率最高。4．对出现病毒载量反弹的20例患者反弹后耐药突变情况进行常规方法检测，其中5例焦磷酸检测出的突变位点与反弹后突变位点相符。对部分患

8、者进行多位点、多时间点标本进行焦磷酸测序和常规测序，观察到劣势耐药株在药物压力下逐渐成为优势株、焦磷酸测序早于常规测序发现劣势耐药株等现象。【结论1：本研究在国内首次建立焦磷酸测序检测HIV-1劣势耐药株的平台，针对HIV-1的B及AE亚型的多个位点独立设计、完善测序方法。从HIV／AIDS初治队列中选择基线常规测序无耐药且病毒学治疗失败的患者