SNT2434-2010-贝类包拉米虫病检疫技术.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４３４—２０１０贝类包拉米虫病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犅狅狀犪犿犻狅狊犻狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２４３４—２０１０前言本标准非等效采用了国际动物卫生组织（ＯＩＥ）编写的水生动物疾病诊断手册（２００６版）中２．２．１ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＷＩＴＨ犅犗犖犃犕犐犃犗犛犜犚犈犃犈和２．２．１ＩＮＦＥＣＴＩＯＮＷＩＴＨ犅犗犖犃犕犐犃犈犡犐犜犐犗犛犃等有关章节

2、。本标准的附录Ａ和附录Ｂ为规范性附录，附录Ｃ和附录Ｄ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参加起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘荭、岳志芹、刘建、郑腾、李西峰、韩雪清、贾广乐、梅琳、王彩霞。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２４３４—

3、２０１０贝类包拉米虫病检疫技术规范１范围本标准规定了包拉米虫病检疫时的样品采集、组织印迹、病理切片以及ＰＣＲ检测时的操作规程。本标准适用于牡蛎等水生动物及其产品中携带牡蛎包拉米虫（犅狅狀犪犿犻犪狅狊狋狉犲犪犲）、包拉米原虫（犅狅狀犪犿犻犪ｓｐ）等包拉米虫的检疫，也可用于养殖场包拉米虫病的监测。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注

4、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样ＳＮ／Ｔ１１９３基因分析检测实验室技术要求３术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１包拉米虫病犅狅狀犪犿犻犪狊犻狊；犅狅狀犪犿犻狅狊犻狊由牡蛎包拉米虫（犅狅狀犪犿犻犪狅狊狋狉犲犪犲）、包拉米原虫（犅狅狀犪犿犻犪ｓｐ）等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。３．２犛犛犝狉犇犖犃小亚基核糖体ＤＮＡ，为生物物种较为保守的ＤＮＡ片段，常被作为物种分

5、类及鉴定的依据。４概述包拉米虫病是严重危害世界贝类养殖业的主要疾病，也是ＯＩＥ规定的贝类必报疫病之一。病原为包拉米虫，现发现的包拉米虫包括五个种，除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包拉米虫（犅．狅狊狋狉犲犪犲）外，还有寄生在悉尼牡蛎体内的犅．狉狅狌犵犺犾犲狔犻、欧洲牡蛎体内的犅．犲狓犻狋犻狅狊犪、美国牡蛎体内的犅．狆犲狉狊狆狅狉犪、澳大利亚牡蛎体内的犅．ｓｐ。天然宿主包括欧洲牡蛎、新西兰牡蛎、阿根廷牡蛎、葡萄牙牡蛎、中国鹑螺，不能感染太平洋巨蛎、美洲牡蛎、河蚌等贝类。感染后症状主要表现为闭合肌萎缩、退色成黄色，颗粒性白细胞

6、增生，出现灰白色小溃疡或穿孔性溃疡、血细胞破裂、血球渗出。性腺、套膜、鳃出现大范围损伤，并最终导致死亡。５材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。５．１涂有氨基烷基硅烷（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｓｉｌａｎｅ）粘附剂的载玻片。５．２姬姆萨染液、苏木精伊红染色液、伊红染液、返蓝液、Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ固定液等，配制方法见附录Ａ。５．３ＤＮＡ抽提所需要的相关试剂或其他商品化组织ＤＮＡ提取试剂盒，见附录Ｂ。５．４ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、硫酸镁、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ或１０ｍｍｏ

7、ｌ／Ｌ）、ＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡＭａｋｅｒ、电泳上样缓１犛犖／犜２４３４—２０１０冲液等，均为商品化试剂盒中成分。５．５电泳缓冲液：配制方法见附录Ａ。５．６二甲苯、封片树胶。５．７无水乙醇。５．８琼脂糖。６设备６．１生物安全柜。６．２ＰＣＲ仪。６．３电泳仪。６．４凝胶成像仪或紫外透射仪。６．５生物显微镜。６．６－８０℃的超低温冰箱、－２０℃普通冰箱、４℃冰箱。６．７高速冷冻离心机。６．８组织研磨器。６．９高压灭菌锅。６．１０水浴锅。６．１１制冰机。６．１２微量移液器及配套的吸头。７检测方法７．１采样www.bzfxw.c

8、om７．１．１采样点的选择应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取３个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品种，应增加采样点。采样按照ＧＢ／Ｔ１８０８８规定方法进行。７．１．２采样技术要求７．１．２．１有临床症状的牡蛎至少挑选１０条濒死的或可疑的个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装放在密封冷藏的容器中送到