nogo审审66的表达纯化多抗制备以及生物学活性初探

《nogo审审66的表达纯化多抗制备以及生物学活性初探》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、上嫌第二脈料丸学2001级硕士学依枪丈Nogo-66表达、纯化、多抗制备以及生物学活性初探中文摘要目的：Nogo-A分子是近年来发现的存在于中枢神经白质，能抑制神经轴突再生的跨膜蛋白，其两个跨膜区之间存在一个66氨基酸的结构域，Nogo-66o目前已有研究证实，Nogo・66对神经细胞突起再生有明显的抑制作用，近年来对Nogo-66分子在中枢神经损伤后修复与再生中的研究已越来越引起人们的兴趣。本实验旨在通过克隆Nogo-66分子基因，构建原核表达载体，诱导表达并纯化得到Nogo-66融合蛋白；将融合蛋白免疫家兔，获得相应多克隆抗体，然后对融合蛋白和多克隆抗体进行初步生物学

2、检测。为进一步探索Nogo-66在中枢神经损伤中的作用及其可能的干预措施打下良好的基础。1=1方法：1）采用pET-28a（+）表达载体，通过PCR方法从pGEX-KG-Nogo-66质粒中扩增出GST-Nogo-66基因，构建成pET-28a（+）-GST-Nogo~66质粒，转化至BL21大肠杆菌，筛选、鉴定并经测序验证；2）IPTG诱导表达6*HIS-GST-Nogo-66融合蛋白，利用表达的工程蛋白上具有6个组氨酸（H1S）的特性，采用变性、以及变性后复性的方法，通过Ni・NTA亲和层析柱得到纯化的Nogo-66融合蛋白，并经Western-blot验证；3）将纯

3、化的融合蛋白与弗氏佐剂充分乳化后免疫新西兰兔，获得兔抗血清，经饱和硫酸披纯化，获得初步纯化的兔抗大鼠Nogo-66融合蛋白多克隆抗体，并用该多克隆抗体，通过Western-blot方法检测大鼠脑、脊髓匀浆中Nogo的表达；4）用Nogo-66融合蛋白作用于PC12细胞，然后用多克隆抗体阻断Nogo-66分子后观察PC12细胞体外生长情况。结果：1）获得大鼠Nogo-66基因工程菌克隆，该克隆可表达6*HIS-GST-Nogo_66融合蛋白；2）获得纯化的6*HIS-GST-Nogo_66融合蛋白，上矗第二匪科丸孝2001CL嶼士李住掩丈中丈摘要该蛋白具有一定的免疫原性；3

4、）用Nogo-66融合蛋白免疫新西兰兔，获得初步纯化的兔抗大鼠Nogo-66特异性多克隆抗体，效价达1：10000,该抗体能够检测大鼠脑、脊髓匀浆中Nogo蛋白，4）体外细胞实验表明Nogo-66融合蛋白能抑制PC12细胞突起生长;而所制备的多克隆抗体能够阻断Nogo-66分子对PC12细胞突起生长的抑制作用。结论：经基因工程诱导表达的Nogo-66融合蛋白具有免疫原性，将其作为抗原免疫家兔后制备的兔抗大鼠Nogo-66多克隆抗体，能够与大鼠脑、脊髓匀浆中的Nogo蛋白结合；同时研究结果表明该克隆表达的Nogo-66融合蛋白对PC12细胞突起生长有抑制作用，而制备的多克隆

5、抗体能够阻断Nogo-66融合蛋白分子对PC12细胞突起生长的抑制作用，表明本研究制备的Nogo-66融合蛋白和相应抗体都具有良好的生物学活性。Nogo-66融合蛋白的成功表达和抗Nogo-66多抗的制备为中枢神经损伤后再生与修复的进一步研究奠定了坚实的实验基础。关键词：Nogo-66，基因克隆和表达，多克隆抗体，PC12细胞上弘第厶压科之第欣士母隹桧冬Cloning,ExpressionofNogo-66andPreliminaryStudyonitsFunctionAbstractObjective：Nogo-A,arecentlyidentifiedtransmem

6、braneProteininCentralNervousSystem(CNS)whitematter,isreportedtohaveinhibitoryactivityonCNSaxonregeneration^anda66-residueextracellulardomainofNogo-AexertinhibitiononCNSaxonalextension.ThestudyofNogo・66andit，sroleonCNSregenerationarouseincreasinginterestinrecentyears.Theaimofthisstudyistor

7、econstructNogo-66vector,obtainpurifiedNogo-66fusionprotein;thenimmunizetherabbitwithNogo-66fusionproteintogetpolyclonalantibodies・Furthermore,wetriedpreliminarybiologicalstudywithfusionproteinandpolyclonalantibodyontheirfunction.Methods：1)ToCloneGST・Nogo・66genefromp