酵素活性测定分析

《酵素活性测定分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、詈專莎『Hfflwsaf碱谦S-IB1sBi8A9306042m3ssA9306074s剜sA9306052»温吩A9306082曲«篩目錄細菌細胞的測定P-2生長曲線P-2Micropipet使用p.2分光光度計使用p.3培養基製作、劃菌、勾菌P-4生長曲線測定P-4DNA分離與分析p.7質體DNA分離（鹼溶裂法）p.7洋菜膠電泳分析P-7蛋白質之分離、純化與分析P-10p.10p.10p.13p.13離子交換層析分離P-10金屬層析分離蛋白質電泳酵素活性測定分析酵素活性之維持反應流程P-15參

2、考資料P-19細菌細胞的測定生長曲線一、目的1•利用培養基的添加碳源不同，探討大腸桿菌Eco〃在不同碳源環境下的菌株生長情形。2•了解細胞如何產生代謝乳糖的機制二、原理1•當溶液內養分面臨不足時，細胞會開始想辦法利用其他的來源加以轉化成養分吸收，同時也因為養分的不足而造成生長緩慢(甚至出現停滯)2.當養分充足的時候，細胞只會吸收養分，而避免產生轉化的作用，產生不必要的反三、實驗步驟(1)Micropipet使用:1.依據吸取溶液體積選擇Pipet型號。2.設定體積時，若由低旋到高值，則需超過設定值

3、三分之一的刻度；若由高旋至低值，則直接旋至設定值。且在轉時避免超過設定值之最大與最小值。1.套上適當Tip並以下圖方式吸取溶液'盡可能將Tip與液面垂直，且小心緩慢地操作。2.釋放溶液時，將Tip接觸管壁，慢慢壓下按鈕至第一段，過1〜2秒再壓下笫二段。注意事項：a.勿將Pipet浸入溶液。b.吸取酸液或具腐蝕性溶液後，請將微量吸管拆解開，各部位零件以蒸餾水沖洗乾淨，擦乾後再正確組合回復原狀。c.微量吸管的任何部份切勿用火燒烤，亦不可吸取溫度高於70°C的溶液，避免蒸氣侵入腐蝕活塞。d.吸取黏度高溶

4、液，請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大，並先行預潤後再吸取。e.套有微量吸管頭的微量吸管，無論微量吸管頭中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。f.用完Pipet後，將其調回量取範圍最大值，以避免彈簧彈性疲乏。（2）分光光度計使用：A.基本操作1.開機並設定儀器（若欲測定波長均在340nm以上，則需記得將Deuterium光源關閉）。2.將空白試樣放入儀器中歸零，再放入樣品量取B.牛血清蛋白濃度測定1•取lmg牛血清蛋□溶於10mL蒸餾水，當標準液。2•將標準液稀釋成不同倍率，作吸收度測定（

5、與水比較）。3.取吸收度在0.2〜0.8的樣品（至少要五點）作檢量線4•若標準偏差在0.999左右則Pipet及分光光度計應有一定技術水準。(3)基製作、劃菌、勾菌:A.培養基製作(LB)：1•配製l%Bactotryptone、0.5%Bactoyeastextract、l%NaCl，並以5NNaOH調至pH7.0°(%為重量百分比)2•用濕式滅菌法滅菌30分鐘。2.待冷卻至50度左右，便在無菌操作台視需要決定是否加入抗生素(A液)。3.若在步驟(1)中加入Agar，便可利用倒在培養皿來作LB-

6、plate。B.劃菌落：1•以滅菌牙籤(或鉗錶圓環)沾取菌落，並在上法所作之plate以下圖方式劃出橫線。2.將培養皿倒置，並在其上標示記號及日期，於適當環境培養。A.勾菌：1•無菌操作下，取一適當試管(已滅菌過)，一手打開試管蓋，加熱管口後，以Pipet吸取3mLA液於試管。2.將已沾菌落的竹籤伸到溶液內攪一攪，再將管口過火後，把蓋子蓋回。3.將試管放置於適當環境培養。B.注意事項：1.只要沾過菌的器具或培養基，均需滅菌。桌面或地面沾到菌液均要以漂□水擦拭過或者以高壓滅菌槽滅菌。2.本實驗以E.

7、coli為例，而酵母菌或E.coli的最佳培養環境為37度。因此隨著培養菌種的不同，需應調整環境。(4)生長曲線測定：1•取兩個滅菌過的三角瓶'各用吸量管吸30mLLB培養基(1%Tryptone、0.5%Yeastextract、1%NaCl)。而兩個均加入glucose(0.5%)，其中一個多加lactose(l%)以標籤標明。2.取培養過的E.coli菌液ImL各加入此兩瓶中。將兩瓶拿去適當環境培養(37°C,170rpm)3.以LB培養基作blank，將兩瓶每隔1小時測一次光學密度OD60

8、0(包含為培養前作為0時。且吸收度超過0.8時，需稀釋至0.8以下，再借由稀釋倍率來求得光學密度)至到達生長曲線之停滯期時停止。四、實驗結果Glucose&Lactose+GLUCOSE亠LACTOSE+GLUCOSE35225■亠(S6SQO234567Time(hr)五、討論此實驗是未完成的，因為做的時間太少，理論上要做到Lactose的生長曲線會繼續在成長，如下圖理論上應該是這種曲線Time(hr)在同時存在glucose和lactose的培養基下，菌株會先利用單醜形式的gl