酵素活性測定分析

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1、基礎生物分子工程實驗指導老師：李振綱教授楊佩芬學姊簡良榮學長組員：A9306042曾楷翔A9306074張家健A9306052高鴻哲A9306082余亭緯目錄細菌細胞的測定P・2生長曲線P-2Micropipet使用p.2分光光度計使用P-3p・4p・7P・7P・7p.10p.10培養基製作、劃菌、勾菌P-4生長曲線測定DNA分離與分析質體DNA分離（鹼溶裂法）洋菜膠電泳分析蛋白質之分離♦純化與分析離子交換層析分離金屬層析分離P-10蛋白質電泳P-10酵素活性測定分析P.13酵素活性之維持P-13

2、反應流程p.15參考資料P-19細菌細胞的測定生長曲線一、目的1•利用培養基的添加碳源不同，探討大腸W®E.coli在不同碳源環境下的菌株生長情形。2•了解細胞如何產生代謝乳糖的機制二♦原理1•當溶液內養分面臨不足時，細胞會開始想辦法利用其他的來源加以轉化成養分吸收，同時也因爲養分的不足而造成生長緩慢(甚至出現停滯)2•當養分充足的時候，細胞只會吸收養分，而避免產生轉化的作用，產生不必要的反、實驗步驟(1)Micropipet使用:1.依據吸取溶液體積選擇Pipet型號。2.設定體積時，若由低旋到

3、高値，則需超過設定値三分之一的刻度；若由高旋至低値，則直接旋至設定値。且在轉時避免超過設定値之•最大與最小値。1.套上適當Tip並以下圖方式吸取溶液，盡可能將Tip與液面垂直'且小心緩慢地操作。ABCD1.釋放溶液時，將Tip接觸管壁，慢慢壓下按鈕至第一段，過1〜2秒再壓下第二段。注意事項：a.勿將Pipet浸入溶液。b.吸取酸液或具腐蝕性溶液後，請將微量吸管拆解開，各部位零件以蒸餾水沖洗乾淨，擦乾後再正確組合回復原狀。c.微量吸管的任何部份切勿用火燒烤，亦不可吸取溫度高於70°C的溶液，避免蒸氣

4、侵入腐蝕活塞。d.吸取黏度高溶液，請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大，並先行預潤後再吸取。e.套有微量吸管頭的微量吸管，無論微量吸管頭屮是否有溶液，均不可平放，需直立架好。f.用完Pipet後，將其調回量取範圍最大値，以避免彈簧彈性疲乏。（2）分光光度計使用：A.基本操作1.開機並設定儀器（若欲測定波長均在340nm以上，則需記得將Deuterium光源關閉）。2.將空白試樣放入儀器中歸零，再放入樣品量取B.牛血清蛋白濃度測定1.取lmg牛血清蛋白溶於10mL蒸餾水，當標準液。2.將標準液

5、稀釋成不同倍率，作吸收度測定（與水比較）。3.取吸收度在0.2〜0.8的樣品（至少要五點）作檢量線4•若標準偏差在0.999左右則Pipet及分光光度計應有一定技術水準。(3)培養基製作、劃菌、勾菌：A.培養基製作(LB):1•配製l%Bactotryptone、0.5%Bactoyeastextract、l%NaCl、並以5NNaOH調至pH7.0。(%爲重量百分比)2.用濕式滅菌法滅菌30分鐘。3.待冷卻至50度左右，便在無菌操作台視需要決定是否加入抗生素(A液)。4.若在步驟⑴中加入Agar

6、，便可利用倒在培養皿來作LB-plate。B.劃菌落：1•以滅菌牙籤(或鉗錶圓環)沾取菌落，並在上法所作之plate以下圖方式劃出橫線。2.將培養皿倒置，並在其上標示記號及日期'於適當環境培養。C.勾圉:1•無菌操作下，取一適當試管(已滅菌過)，一手打開試管蓋，加熱管口後，以Pipet吸取3mLA液於試管。2.將已沾菌落的竹籤伸到溶液內攪一攪，再將管口過火後，把蓋子蓋回。3•將試管放置於適當環境培養。D.注意事項：1.只要沾過菌的器具或培養基,均需滅菌。桌面或地面沾到菌液均要以漂白水擦拭過或者以高

7、壓滅菌槽滅菌。2.本實驗以E.coli爲例，而酵母菌或E.coli的最佳培養環境爲37度。因此隨著培養菌種的不同，需應調整環境。(4)生長曲線測定：1•取兩個滅菌過的三角瓶'各用吸量管吸30mLLB培養基(1%Tryptone、0.5%Yeastextract、1%NaCl)。而兩個均加入glucose(0.5%)，其中一個多加lactose(l%)以標籤標明。2.取培養過的E.coli菌液ImL各加入此兩瓶屮。將兩瓶拿去適當環境培養(37°C,170rpm)3.以LB培養基作blank，將兩瓶每

8、隔1小時測一次光學密度OD600(包含爲培養前作爲0時。且吸收度超過0.8時，需稀釋至0.8以下，再借由稀釋倍率來求得光學密度)至到達生長曲線之停滯期時停止。四、實驗結果Glucose&Lactose+GLUCOSE亠LACTOSE+GLUCOSE35225■亠(S6SQO234567Time(hr)五、討論此實驗是未完成的，因爲做的時間太少，理論上要做到Lactose的生長曲線會繼續在成長，如下圖理論上應該是這種曲線Time(hr)在同時存在glucose和lactose的培養基