重组人TGF（医学论文）

《重组人TGF（医学论文）》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、重组人TGF【关键词】重组expression,purificationandidentificationofrecombinanthumanTGFp1fusionprotein[Abstract]AIM:Toclone,expressandpurifyhumantransforminggrowthfactorpi(TGFpl)inE.coli.METHODS:A336bpofhumanrhTGFp1genefragmentwasobtainedbyRTPCRandclonedintopGEX4Tlvector,aGSTfusionexpressionvector・Theplasmidw

2、astransformedintoE.coliDH5aandinducedtoexpressfusionproteinGSTrhTGFp1withIPTG.TheexpressionofrhTGFp1wasdetectedbySDSPAGEandWesternBlot.RESULTS:Anovelproteinwithexpectedmolecularmasswasexpressed・TheexpressedproductshowedagoodbindingabilitytoantirhTGFp1monoclonalantibody.CONCLUSION:Oursuccessfulclo

3、ningandexpressionofrhTGF01geneandpurificationofrhTGFp1proteinlayabasisfortheproductionofrhTGFp1autovaccine.【Keywords]transforminggrowthfactor^1;recombinantfusionproteins/isolation&purification;pGEX4Tlvector【摘要】目的：构建人转化生长因子Pl(TGFP1)基因的原核表达载体，表达并纯化GSThTGFpi.方法：应用RTPCR获得人TGFpl的基因片段，成功构建人TGFP1原核表

4、达载体，诱导表达人TGFpl与GST的融合蛋白；应用亲和层析法纯化重组融合蛋白，对纯化产物进行SDSPAGE电泳分析和WesternElot检测分析.结果:成功构建了人TGFpl重组融合表达质粒PGEX4T1TGFP1,表达的蛋白经SDSPAGE电泳分析，在Mr约为39X103处出现了一条新生的蛋白条带，该表达蛋白具有与TGFP1抗体特异性的结合能力.结论：成功构建了人TGFpl基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物，为下一步的人TGFP1自体疫苗的研制奠定了基础.【关键词】转化生长因子B1；重组融合蛋白/分离与纯化；PGEX4T1载体转化生长因子(31(transforming

5、growthfactorp1,tgfpi)是一种免疫抑制因子，在多种肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用，并几乎在所有内、夕卜中胚层源的实体瘤(包括肝癌细胞)及造血细胞来源的肿瘤中都有表达[1]・其活性结构是由两个结构相同、Mi•为12.5X103的亚单位借二硫键相连成同源二聚体的形式存在，其生物学活性的发挥由细胞膜上的特异性受体介导［2］.研究［3］显示对于高表达TGFpl的晚期肿瘤患者，肿瘤细胞通过自身的调节与适应基本上失去了对TGFpl诱导的生长抑制效应.肿瘤细胞高表达的TGFP1主要是作用于免疫细胞和基质细胞，发挥有利于肿瘤生长和转移的作用•体内阻断TGFpl的生物活性能发挥明显的

6、抗肿瘤作用.我们利用基因重组的方法，构建TGFP1的融合表达载体，为下一步的人TGF01自体疫苗的研制奠定基础.1材料和方法1・1材料E.coliDH5a及质粒pGEX4Tl为本室保存;各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、异丙基0D硫代半乳糖昔（IPTG）（TaKaRa公司）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）;蛋白marker（Fermentas公司）；抗hTGFplmAb（Invivogen公司）；羊抗小鼠二抗（华美生物工程有限公司）；碱性磷酸酶显色试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；Trizol试剂盒（GibcoBRL公司）；4£高速离心机（Eeckm

7、an公司）；蛋白质层析设备（AmersharmPharmaciaBiotech公司）・1.2.1外周血单个核细胞的分离、培养［4］及总RNA的提取分离外周血单个核细胞按常规方法进行；细胞总mRNA的提取按GibcoERL公司的Trizol试剂盒说明书进行，用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度.-7（TC保存RNA备用.1.2.2RTPCR及PCR扩增目标序列以人外周血单个核细胞总mRNA为模板，根据Genbank提供的hTG