临床医学论文重组人类精囊蛋白的制备及功能研究

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1、临床医学论文-重组人类精囊蛋白的制备及功能硏究=1=【摘要】目的制备重组精囊蛋白(semenogelin,Sg)'硏究其对精子活动的影响。方法设计特异性的引物，用分子克隆技术从精囊cDNA文库中扩增精囊蛋白Sg，再将DNA插入质粒载体PET100，筛选序列止确的阳性克隆，转染BL2KDE3)大肠埃希菌，诱导表达重组人类Sg蛋白，用500g/LNi-NTA纯化重组蛋白，用正常人的通过上游法筛选出的活动精子行抑制分析，硏究重组Sg在4种不同浓度0，1ng/“L、5ng/“L、10ng///L下对精子活动的影响。结果重组Sg在5ng//zL

2、>10ng//zL浓度下明显抑制精子的运动(P<0.001)。结论Sg分子明显抑制精子运动，精液液化过程中，必须清除Sg中具有抑制功能的片段，精子才能前向运动。【关键词】精子活动；前列腺特异性抗原；重组技术；精囊蛋白射精后的人类精液自发性凝固成最初的胶冻状态，随后的精液液化过程屮，前列腺来源的蛋白激嗨分解精液中的抑制精子活动的凝固蛋白，从而释放精子的运动。引起精液凝固的蛋白质主要是来自精囊分泌的含量丰富的精囊蛋白(semenogelin,Sg)5Sg具有抑制精子活动的作用〔1・2〕，其相对分子质量为52000，由精囊上皮细胞特异性分泌

3、，在精囊中被蛋白C抑制剂(proteinCinhibitor,PCI)保护，以防被其他蛋白酶分解。射精后，Sg与精子表面的附睾蛋白激嗨抑制剂Eppin结合〔3・4〕，精液液化过程中，前列腺特异性抗原(prostate-specificantigen,PSA)将Sg分了中的抑制片段水解成许多相对分子质量<10000的小片段'精子才能开始活动。从精液中分离的许多Sg的水解片段具有各种各样的生物活性〔5〕，认识不同的Sg分解片段对精子的影响，对调控精子的获能及受孕极为重耍，也可为进一步认识精液液化的分子机制提供重要帮助。本文利用分子克隆技术

4、体外重组人类精囊蛋白Sg，硏究其对精子运动活性的抑制。1材料与方法1.1实验材料本实验所用化学试剂和生物制剂均购自美国Sigma公司，PET-100质粒购自Invitrogen公司，质粒纯化试剂盒(QiaquickPCRPurification)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)试剂盒购自美国Qiagen公司(Valencia,CA)稳定素(P)购自Mi11iporc公司(Bedford,MA)°1.2重组Semenogelin蛋白的制备在引物前端加上CACC碱基，以利于插入PET100载体,重组

5、全长6-His-Semenogelin的引物：上游引物：5'・CACCGGTGGATCAAAAGGCCGATTACO3'；下游引物：5'・CTATCGGCCATGCTGTTGATCTTG・3'。以精囊cDNA文库为模板扩增Sg。用PfxPlatinium多聚B(Invitrogen,Calsbad,CS)，在94°C变性15s，55°C复性30s和68°C延伸1min，共28个循环。为将PCR合成的DNA克隆到载体质粒PET100中，设置克隆反应体系，在Topo克隆反应中按照PCR产物DNA与Topo载体PET100分子比率0.5：1

6、到2：1的比例加入，其组成：PCR产物4“L，盐溶液1//L^Pet-100W1“L，总量6“L。轻轻混匀，常温孵育5min，然后转染Top10E.coli细胞。分析转染体，筛选阳性克隆，阳性克隆质粒基因序列均经DNA测序证实正确后，转染E.coliBL21，1mmol/LIPTG诱导重组蛋白的表达。大量的蛋白以可溶的形式存在于胞浆中，重组蛋白的纯化用500g/LNi-NTA树脂，采用pH値从8.0至6.3的相同缓冲液(100mmol/LNaH2P04,10mmol/LTris-HCl»8mol/LUrea)先洗涤未与树脂结合的杂质，

7、再用pH値4.5缓冲液将结合在树脂上的重组蛋白洗涤出来。重组Sg蛋口全长氨基酸片段为笫24-283位氨基酸。纯化的重组蛋白均在PH7.0标准磷酸盐缓冲液(PBS)中透析24h，恢复蛋白质的活性。1.3Western印迹分析重组Sg蛋白在10%・20%梯度凝胶(Bio-Rad)中电泳分离'或在4%・12%梯度NuPAGEBis-Tris胶(Invitrogen)中进行，并转移到Immobilon-P(Mi11ipore)膜上，转移膜用酰胺黑染色或用含30g/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液(50mmol/LTris，pH7.4，150mmo

8、l/LNaCl)在室温条件下封闭60min，冲洗后加入1:2000稀释的一抗(兔抗人SgS20H或鼠抗人MHS-5)在常温下孵育膜1h，再用TBS缓冲液洗涤膜2次，加入碱性磷酸輛标记二抗(羊抗兔的IgC；H：2000稀释