荧光定量数据分析

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1、定量PCR：数据处理报告人：丁达021-58205386dingda@orbital.com.cn材料来源：陈云地博士（美国应用生物系统公司技术专家）内容提要∑定量PCR的实验要素∑定量PCR的实验目的∑定量PCR的数据处理2定量PCR的实验要素定量PCR实验要素¾目标基因未知样品¾产生标准曲线标准品¾监控试剂、系统阳性对照¾监控污染阴性对照¾数据之间可比性内对照(IPC)¾校正操作误差参比荧光(ROX)¾降低定量误差3-6复管496-孔板设置举例阳性对照标准品阴性对照未知检材5DNA样品©模板可以是DNA、cDNA或者质粒©RNA需要先反转录成cDNA；反应只能以cDNA为模

2、板，但是可以通过标准曲线或者相对定量直接定出RNA的数量或者比例©DNA纯度：OD/OD=1.8，可以在1.6~2.0之间260280=1.8:纯DNA>2.0:RNA污染<1.6:蛋白质/酚污染©DNA用量：基因组DNA：0.1ng–1ug，最好10-100ng/rxn©来源：血样、组织等©自己制备（血样：如蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，酒精/NaAc纯化）6RNA样品©RNA用量：60ng–2ug/RT-rxn；©RNA纯度：OD/OD=2.0260280©来源：血样、组织、病毒等©反转录：100uL的反应体系可以将最多2ug总RNA反转录成cDNA；如果总RNA>2ug，分

3、开做复管©cDNA用量：1-100ngRNA反转录所得cDNA加1uL/rxn7标准品的要求logXlog(R−R)−logROTBSC=−+Tlog(1+E)log(1+E)XX©标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系©不要求：©数学关系是抽象的、普适的，不要求标准品与目标基因一定具有相同的生物学意义©所以，同一个片段可以使用，不是同一个片段也可以使用©任何DNA片段，PCR产物、质粒、病毒的PCR片段等均可©要求：©浓度已知©PCR效率尽量接近，越一致误差越小©同样条件下完成：同样的仪器、试剂、循环参数、同一次实验©同样质量的模板、同样Tm值的引物和探针8P

4、CR效率对定量结果的影响n=30E=1.95N=N(1.95)30=Nx5.0x10800相差2.2倍n=30E=1.90N=N0(1.90)30=Nx2.3x1080N:numberofamplifiedmoleculesn:numberofamplificationcyclesN0:initialnumberofmoleculesE:amplificationefficiency9PCR扩增效率的测定E=10-1/斜率10梯度稀释方法©5点以上，已知浓度（相对定量）/拷贝数（绝对定量）©购买，或者自己制备©制备方法：选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释

5、©CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间©10倍连续梯度稀释操作方法：取1v标准品原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii取1v稀释的标准品(标准品ii)+9v稀释缓冲液，得标准品iii取1v稀释2次的标准品(标准品iii)+9v稀释缓冲液，得标准品iv取1v稀释3次的标准品(标准品iv)+9v稀释缓冲液，得标准品v切不可由标准品i加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v11标准品单位问题©标准品的性质决定最终结果的性质：DNA标准品，已知拷贝数→绝对定量，得未知样品拷贝数DNA标准品，已知ng/uL→绝对定量，得未知样品ng/uLDNA标准品，未

6、知拷贝数或浓度，已知稀释倍数→相对定量，得未知样品之间相差倍数RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA→相对定量，得未知样品ngRNA/uL©注意测定对单位的要求如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）12要做几条标准曲线？RelativeStandardCurv

7、eComparisonofthec-mycexpressionlevelinbrain,kidney,liverandlungStandard:RajiCelllinetotalRNAEndogenousControl:GAPDH20-••⊗CTargetgene19-••••C••C⊗••BT18-⊗••B••17-⊗•A•⊗••16-Endogenouscontrol••A15-⊗••••Amounts.IIIIII(pg)1000200040008000160003200013阳性内对