荧光定量PCR实验及数据分析

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1、荧光定量PCR实验原理及数据分析SangonBiotech(Shanghai)Co.,Ltd.内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南www.sangon.com2荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测www.sangon.com

2、3荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值www.sangon.com4荧光定量PCR原理－－扩增曲线平台期荧光基团Lg－linerphaseRn（荧光强度）Baseline荧光检测元件Cycle（循环数）www.sangon.com5荧光定量PCR原理－－荧光阈值平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的Lg－linerphase10倍Threshold（荧光强度）手动设置:大于荧光背景值和阴Rn性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段Baseline真正

3、的信号:荧光信号超过阈值Cycle（循环数）www.sangon.com6荧光定量PCR原理－－Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值Ctvalue时所经过的扩增循环次数Rn（荧光强度）Cycle（循环数）www.sangon.com7荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性纵轴：荧光信号量横轴：PCR反映循环数Ct值的特点：•相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；•Ct值极具重现性www.sangon.com8荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理n理想的PCR反应Xn＝X0*2n：扩增循环数X：起始模板数量0X

4、：第n次循环后扩增产物数量nwww.sangon.com9荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应X＝X*（1＋En）nn0n：扩增循环数En：扩增效率X：起始模板数量0X：第n次循环后扩增产物数量nwww.sangon.com10荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时X＝X*（1＋En）Ct＝M（1）Ct0X：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，Ct它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX*（1＋En）Ct（2）220整理方程式（2）：LogX=LogM-CtLog（

5、1＋En）2022www.sangon.com11荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系SampleCk102Ck104模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CyclenumberLgofDNAconcentrationwww.sangon.com12荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认•线性关系、扩增效率确认–相关系数（R2）：大于0.98–标准曲线斜率：-3－-3.5–PCR扩增效率（E）：0.9-1.2•检测灵敏度确认–35Cycles内可得到好的定量结果–如果采用SYBR检测

6、方法，30Cycles内无非特异性产物扩增•Notemplatecontrol确认–35Cycles内无引物二聚体产生www.sangon.com13内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南www.sangon.com14常用荧光定量标记方法•非特异性荧光标记•SYBRGreenI•特异性荧光标记•TaqManProbewww.sangon.com15SYBRGreenI染料法－－原理•SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的

7、染料。SYBRGreenIwww.sangon.com16SYBRGreenI染料法－－作用机理热变性引物退火延伸反应www.sangon.com17SYBRGreenI染料法－－问题点与关键点•问题点：–SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。•关键点：–设计合适引物，防止非特异性扩增！www.sangon.com18SYBRGreenI染料法－－融解曲线原始图谱对数图谱将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)www.sangon.com19SYB

8、RGreenI染料法－－融解曲线融解曲线分析，单一峰