克隆测序要点

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1、克隆测序克隆测序就是将要测序的片段插入到克隆载体中，获取含有待测片段的质粒，然后进行测序。PCR产物为什么要克隆测序答：应该是确认-下，你所扩的条带是不是你想要的序列。因为PCR扩增中可能会有错配。测序反应开始和结束的-些序列不够准确，所以最好将待测序克隆到载体上测序。另外用载体测效率较高，模扳量大，纯度高。技术路线：样品的采集基因组DNA提取与检测引物合成与稀释PCR扩增、PCR产物的回收纯化、连接和转化测序主要原理:蓝白斑筛选  蓝白斑筛选蓝白斑筛选是-种基因工程常用的重组菌筛选方法。　　野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-

2、吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。　　设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段-个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有-段称为lacz'的基因，lacz'中包括：-段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；-个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源D

3、NA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。　　操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽

4、链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。　　实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选-同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有-种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，-次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。T-A克隆　　TA克隆方法（OriginalTACloningKit）把PCR片断与-个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PC

5、R反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加-个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。　　所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理,不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。主要试验仪器PCR仪（MJResearch）；DNA/RNA浓度测定仪；多功能电泳系统；计算机凝胶成像系统；DK-98-I电子恒温水浴锅；DYY-III型水平电泳槽(北京)；JY6

6、00稳压稳流电泳仪(江苏)；微波炉，摇床；TCL16高速台式离心机(上海)；紫外分光光度仪；荧光显微镜(日本OLYMPUS)等。主要的试验试剂10、LB培养液体基：胰化蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCl10g，定容至1000ml。11、LB培养固体基：液体培养基加15g琼脂/1000ml。12、X-gal-IPTGLB固体培养基：在含有氨苄青霉素的LB培养基琼脂平板上加40μlX-gal贮存液和4μlIPTG溶液，用涂菌棒涂匀。13、氨苄青霉素贮存液：100mg/ml,-20℃保存。14、X-gal：5-溴-4-氯-3吲哚-β-半乳（毗喃）糖苷。用二甲基甲酞胺溶解，配制

7、成20mg/ml的贮存液。保存在-玻璃管里，用铝箔封裹，-20℃保存。15、IPTG：为异丙基硫代β-半乳糖苷，在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，再用蒸馏水定容至10ml，过滤除菌后分装1ml的小管，-20℃保存。1.1菌株和质粒载体常见的菌株：EcoliJMl0常见的载体：pGEM—T载体PMD-18载体PUCm-T载体pMD18-TVector(T载体)可购自大连宝(TakaRa)生物工程有限公司.1.2试验方法1.2.1基因组DNA的制备与检测将裂解的冻全血加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，混匀，55